供稿：赵晨茜，武汉大学
校稿：刘亚君，武汉大学
推送：刘亚君，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Nature Communications上，标题为5' UTR G-quadruplex structure enhances translation in size dependent manner。通讯作者是来自约翰霍普金斯大学生物物理系的Sua Myong教授。
细菌由于缺乏核膜，需要快速转录后调控来应对环境刺激。细菌mRNA的5’ 非翻译区（5' UTR）具有多种功能，这些功能对基因调控和蛋白质合成至关重要。5′ UTR中的二级结构在调节RNA稳定性和翻译效率方面发挥重要作用，特别是共转录折叠结构可以影响翻译起始和翻译速度。研究表明，位于Shine-Dalgarno（SD）序列附近的RNA G-四链体（RG4）结构通过干扰16S rRNA和mRNA之间的碱基配对来抑制翻译。越来越多的证据表明，RG4结构参与了真核生物的翻译调控，通常在5′ UTR中存在时阻止翻译起始。一些RG4结构还被证明可作为内源性核糖体进入位点（IRES），独立于起始位点刺激翻译。尽管这些研究揭示了RG4的作用，但RG4在5′ UTR中对细菌基因调控的影响及其程度仍不清楚。
首先，本研究为了量化翻译效率，作者设计了体外翻译实验，使用T7 RNA聚合酶和大肠杆菌翻译系统，同时检测编码超折叠GFP（sfGFP）的荧光强度，以计算翻译效率（图1）。在T7启动子和核糖体结合位点（RBS）之间插入G4序列（PQS），比较模板链（T）和非模板链（NT）的效果（图2）。结果显示，NT中的PQS生成的G4结构使转录效率提高约30%，但sfGFP荧光强度提高五倍（图2）。N-甲基中卟啉IX（NMM）检测显示，仅NT中形成标准的RG4，证实了RG4结构提高了翻译效率（图2）。
图1 体外共转录及翻译的检测和定量
图2 RG4的存在提高了翻译效率
接着，作者研究了不同PQS序列对翻译增强的影响。研究发现，所有含有RG4的RNA的PQS-NT构建体都比对照及其PQS-T构建体表现出更高的翻译水平（图3）。进一步分析显示，RG4的环长度与翻译效率高度相关，环长度较长的RG4结构推动了翻译增强（图3），这表明RG4的大结构加强了翻译增强效应。
图3 环长度较长的RG4促进翻译增强
此外，作者检测了5′ UTR别的结构对翻译的影响，发现发卡结构能进一步增强翻译，但仅当与RG4结构同时存在时（图4）。接着，本研究为了探索了RBS上游的5′ UTR结构如何增强翻译，进行了一项竞争性实验。在该实验中，作者向翻译反应中添加带有RG4的竞争性RNA（图5）。结果表明，带有RBS的RNA显著降低了翻译水平，而其他条件的影响很小，这表明RG4并不增加与核糖体的亲和力。本研究为了探索RG4的形成是否会增加RBS对核糖体的可及性，作者使用含有与RBS互补序列的分子信标来检验RBS的可及性（图5）。结果显示，无论有无RG4，RBS在所有构建中都是完全可及的。因此，RG4不是通过增加RBS对核糖体的可及性来发挥作用。
图4 发夹状结构和RG4协同促进翻译
图5 RG4不招募核糖体或增加RBS可及性
作者进一步探索RG4是否通过稳定mRNA来延长mRNA的寿命。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）结果显示，在翻译后3小时，NT、C和T的mRNA表达水平无差别（图6）。这表明RG4不会影响mRNA的稳定性，且RG4可能通过使核糖体偏向于AUG位置的移动来促进翻译（图6）。接着，作者添加了G4解旋酶DHX36，在翻译反应中发现DHX36的加入降低了翻译水平，但不影响转录（图6）。这表明RG4结构可能是增加翻译的原因。因此，RG4可能通过物理障碍的方式使核糖体偏向于移动到翻译起始位点。
图6 RG4不增加mRNA的寿命，但可以稳定与mRNA结合的核糖体
最后，本研究在大肠杆菌中探索了由发夹和RG4介导的翻译增强效应。作者使用双荧光报告系统，并对GFP和mCherry的表达进行量化处理（图7）。结果显示，在细胞内观察到了与体外相似的RG4依赖型翻译增强模式。这一结果表明，无论是在体外还是在细胞内，5′ UTR结构对翻译有显著影响。
图7 大肠杆菌中的翻译增强效应
综上所述，本研究深入探索了5′ UTR G4结构在体外和细菌翻译中的重要调控作用，为调控基因表达提供了新的研究思路和见解。
文章编号：409
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-48247-8
原文引用：
Chun-Ying Lee#, Meera Joshi#, Ashley Wang and Sua Myong*. 5' UTR G-quadruplex structure enhances translation in size dependent manner. Nat. Commun., 2024, 15(1): 3963. （#为共同第一作者）
