供稿：卢薇，武汉大学
校稿：余思宇，武汉大学
推送：余思宇，武汉大学
今天给大家分享的文献是发表在Environmental Science & Techonology上的文章，标题是Sex-Specific Effects of Environmental Exposure to the Antimicrobial Agents Benzalkonium Chloride and Triclosan on the Gut Microbiota and Health of Zebrafish (Danio rerio)，中国环境科学院的吴丰昌教授和王晨工程师为共同通讯作者。
三氯生（TCS）广泛用于广谱抗菌剂，美国限制TCS使用和2019年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）暴发后，季铵化合物（QACs）中的一大类——苯扎氯铵（BACs）正逐渐作为TCS的替代品被生产出来，导致BAC在水生生态系统中普遍存在。但关于BAC对鱼类的潜在环境健康影响的研究尚显匮乏。
据报道，一些抗菌化合物通过改变肠道微生物群引起肠道生态失调，进而导致肠道完整性受损、易感染、肠道炎症、免疫失调，甚至可能降低存活率。此外，肠道微生物群组成中存在的性别特异性差异，可以影响生物体免疫反应过程和对疾病的敏感性。本研究以斑马鱼为研究对象，将成年斑马鱼分别暴露于0.4、4、40 μg/L 的BAC或TCS中42天，然后进行组织学分析、肠道炎症的蛋白质生物标志物分析、实时定量PCR分析、进食行为评估，旨在验证抗菌添加剂以性别特异性的方式破坏肠道微生物群平衡并损害鱼类健康的假设。
首先，生存曲线模式结果显示，与对照组相比，4、40 μg/L BAC和4、40 μg/L TCS暴露均导致成年斑马鱼存活率降低，同时在相同的暴露浓度下，BAC暴露对雌性和雄性斑马鱼都造成更低的存活率（图1A、B、D、E）。BAC暴露对雌性斑马鱼的致死作用强于雄性，4、40 μg/L BAC组雌性和雄性斑马鱼存活率显著差异（图1C）；TCS暴露存在类似现象，40 μg/L TCS组中该差异显著（图1F）。这些结果表明，长期暴露于BAC和TCS的斑马鱼存活率随剂量增加而降低，其中较高浓度的BAC和TCS显著降低了斑马鱼的存活率。雌性斑马鱼对BAC的毒性更敏感。
图1 BAC或TCS暴露的斑马鱼的生存曲线模式
接着，作者对暴露组斑马鱼进行肠道组织学观察和肠道炎症的蛋白质生物标志物分析。对照组的成年斑马鱼肠道壁呈多层，最内层（粘膜）有高而密、呈指状褶皱的绒毛伸入管腔，结构完整（图2Ai、Bi）。而BAC组、TCS组的成年斑马鱼肠道组织随暴露物剂量的变化可观察到不同程度的小肠结肠炎特征性改变，如肠壁增厚、绒毛结构破坏肠细胞空泡化等（图2A、B、E、F）。BAC、TCS暴露后成年斑马鱼小肠结肠炎评分以剂量依赖式增加，这主要是由肠细胞空泡化和绒毛结构破坏驱动的（图2C、G）。BAC、TCS暴露后雌性和雄性斑马鱼ReL-A（p65）蛋白水平随着剂量的增加而增加，不同的是BAC组雌性斑马鱼p65蛋白水平在0.4 μg/L 观察到变化，而TCS组的最低观察效应浓度为4 μg/L ，值得注意的是BAC组和TCS组中雄性斑马鱼诱导产生的p65 蛋白水平通常低于雌性斑马鱼，特别是在40 μg/L TCS组中存在显著差异（图2D、H）。以上结果表明，在BAC或TCS暴露后，雌性鱼类更容易发生肠道炎症。
图2 BAC或TCS暴露后斑马鱼的肠道组织学分析及p65蛋白水平
作者进一步比较了BAC或TCS暴露后雌性和雄性斑马鱼肠道微生物菌群的多样性和组成，具体而言，BAC、TCS暴露后雌性和雄性斑马鱼Shannon多样性指数和Chao丰富性指数都显著降低，在所有暴露组中除0.4 μg/L TCS以外，雌性斑马鱼的微生物多样性下降幅度都大于雄性，表明雌性斑马鱼肠道微生物组成对BAC、TCS暴露更敏感（图3A、B）。β多样性的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示，BAC和TCS暴露组的肠道微生物群落结构与对照组有明显区别，尤其BAC处理组的分离度更高，表明BAC对肠道微生物群落结构的影响比TCS更显著（图3C、D）。在门水平上，变形菌门和放线菌门的相对丰度在暴露组中呈现增加趋势，且BAC组的雌性斑马鱼趋势比强于TCS组雌性斑马鱼（图3E、F）。
图3 BAC或TCS暴露后诱导的斑马鱼肠道微生物组成的变化
作者通过16S rRNA基因测序分析了BAC或TCS暴露后不同性别斑马鱼中细菌属水平的变化，如图5所示，与对照组相比，BAC组和TCS组分别有22和24个细菌属发生了显著变化，雌性斑马鱼特定属丰度的倍数变化通常比雄性斑马鱼更显著，特别是在低暴露浓度下。
图4 BAC或TCS暴露后斑马鱼肠道特定细菌属的相对丰度变化
为进一步验证假设，作者评估了肠道组织中经典核因子-κB（nuclear factor -κB,NF-κB)信号通路，在模型中，NF-κB在静息状态下被核因子-κB的抑制蛋白（IκB）抑制于细胞质中。当细胞受到炎症刺激时，IκB激酶（IKK）复合体被激活并磷酸化IκB，导致NF-κB的释放并迁移到细胞核，从而调控目标基因的表达（图5A）。暴露于BAC或TCS42天后，在编码经典NF-κB转录因子的所有基因中观察到剂量依赖式增加，总体而言，雌性斑马鱼上调的基因数量明显多于雄性（图5B）。
图5 BAC或TCS暴露后斑马鱼肠道组织中经典NF-κB信号通路的激活及其下游生物学后果
最后，作者探讨了BAC或TCS暴露对斑马鱼摄食行为的影响。在暴露后的前3分钟内，与对照组相比，暴露组的斑马鱼摄食活动减少，这种效应随时间延长而减弱。到5分钟时，仅在BAC和TCS暴露组的最高浓度40 μg/L 下，观察到了在统计学上显著的摄食行为抑制效应。（图6A、B）。
图6 BAC或TCS暴露后斑马鱼摄食行为的影响
综上所述，本研究表明BAC或TCS对斑马鱼的生存和摄食存在不利影响。BAC或TCS长期暴露破坏斑马鱼肠道微生物群平衡，诱导肠道生态失衡，这种失衡可能会激发经典NF-κB信号通路，可能导致肠道完整性受损、免疫反应、炎症反应，并最终导致观察到的存活率降低和摄食抑制。在本研究中，BAC或TCS对雌性斑马鱼的影响更为显著，BAC相比TCS对斑马鱼存在更大毒性。总之，这些发现为斑马鱼肠道组织长期暴露BAC或TCS的潜在毒性提供了新的认识，并为进一步研究提供了基础。
文章编号：431
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.4c03205
原文引用：
Yueyue Liu#, Siyi Lin#, Tong Li, Guomao Zheng, Wen Sun, Lihui An, Yingchen Bai, Chen Wang*, Fengchang Wu*. Sex-Specific Effects of Environmental Exposure to the Antimicrobial Agents Benzalkonium Chloride and Triclosan on the Gut Microbiota and Health of Zebrafish (Danio rerio). Environ. Sci. Technol., 2024, 58, 15450-15462 .（#为共同第一作者）
