供稿：张杉，武汉大学
校稿：史路菲，武汉大学
推送：史路菲，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Nature communications上，标题为Gene body DNA hydroxymethylation restricts the magnitude of transcriptional changes during aging，通讯作者是美国国立卫生研究院的Payel Sen。
衰老是以生理功能的逐渐退化为特征，是致病和死亡的主要危险因素。衰老组织显示出转录组整体的改变，这与基因调控在衰老中的重要作用相一致。表观遗传改变，包括形成染色质结构和调节基因表达模式的机制，是衰老和年龄相关疾病的主要特征，包括癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、肥胖和II型糖尿病。由于表观遗传标记的可逆性，它们为改善与年龄相关的功能衰退提供了有希望的治疗靶点。DNA羟甲基化（5hmC）是DNA甲基化最丰富的氧化衍生物，通常富集在转录活性基因和组织特异性基因的增强子和基因body区上。尽管异常的基因组5hmC与年龄相关疾病有关，但其在衰老中的功能作用尚不清楚。本文中作者以小鼠肝脏和小脑为模型器官，研究了5hmC在衰老中的作用，发现其在与组织特异性功能相关的基因体中积累，并限制基因表达随年龄变化的幅度。
通过对幼龄（~2-5个月）和老年（~18-20个月，每个年龄组 n=4 个生物重复）C57BL/6JN小鼠的基因组DNA（gDNA）中的5mC和5hmC进行全面评估，其中，脑组织中5hmC 的绝对含量最高（~0.51%），其次是肌肉（0.28%）、肝脏（0.24%）、肾脏（0.17%）、心脏（0.17%）、肺（0.15%）和脾脏（0.11%）。老年人和年轻人之间的5mC水平没有显著差异；然而，在老年人和年轻人的肝脏中检测到5hmC水平显著增加（平均差异= 0.24%） (图1A)。点印迹分析和免疫荧光显微镜显示，老年肝组织切片细胞核中的5hmC信号明显高于年轻（图1B-C）。男女均观察到5hmC随年龄增长而增加。综上所述，这些数据表明老年肝脏中5hmC的整体增加。
图1 衰老肝脏中5hmC的整体积累
随后，作者利用羟甲基化DNA免疫沉淀和测序（hMeDIP-seq）研究了5hmC的基因组定位。为了确定全基因组5hmC信号变异的主要来源，作者使用RPKM（每千碱基每百万读数）归一化和输入减去5hmC样本进行主成分分析（PCA）。主成分1 （Principal component 1, PC1）占5hmC信号变异的79.4%，并通过年龄清晰地区分了样本，表明年龄是全基因组5hmC信号变异的主要因素（图2A）。为了确定年龄相关的差异羟甲基化区域（DHMRs），作者使用了QSEA（定量测序富集分析）。QSEA鉴定出老年样品中5hmC显著富集的区域有16,315个（hyper DHMRs, fold change [FC]≥2,FDR < 0.05），年轻样品中5hmC显著富集的区域有13,592个（hypo DHMRs, FC≤- 2,FDR < 0.05）（图2B）。与年轻样品相比，hyper DHMRs中心的5hmC信号在老年样品中可重复地显示出更高的信号，反之亦然（图2C）。作者还使用基因组区域富集注释工具（GREAT）进行了基因本体（GO）分析。富含低DHMRs和高DHMRs的顶部通路主要构成代谢和线粒体相关，包括脂肪酸、小分子和羧酸代谢过程（图2E）。作者将DHMRs与CpG和基因特征进行了分析，结果显示，大多数变化发生在距离CpG岛最远（>4 kb）的区域（intergis）和基因体中，主要是内含子区域（图2F）。此外，检测5hmC信号从所有已知mm10基因的转录起始位点（TSS）到转录末端位点（TES）分布，观察到衰老肝脏中基因体中5hmC的显著积累（图2G）。总之，这些分析表明5hmC在老年肝脏全基因组积累，并在与肝脏特异性功能相关的基因体和区域发生动态变化，主要是肝脏代谢。
图2 在衰老过程中，5hmC在与肝脏代谢相关的基因区域积累
通过追踪低、中、高表达的蛋白质编码基因基因体上的5hmC信号，评估了基因体5hmC与每个年龄组内基因表达之间的关系。根据平均DESeq2标准化mRNA计数进行排序，观察到年轻（图3A，左）和老年（图3A，右）年龄组的基因体5hmC与基因表达之间存在正相关。随后作者计算了所有100组mRNA FC的方差（离散度测量），在年轻人和老年人中，5hmC信号的增加与mRNA FC的变异之间存在很强的负相关（图3B）。将基因分类为随年龄上调和下调的基因，发现下调基因中5hmC信号显著增加，而上调的基因则总体含量较低，但也随年龄增加而增加（图3C）。进一步分析显示，5hmC丰度较高的基因在年龄变化导致的改变幅度较小，尤其是基因body区（图3D-F）。这些结果表明，基因体5hmC水平在衰老组织中稳定富集，并可能对年龄相关的转录变化产生更大的影响。
图3 基因体5hmC限制了衰老过程中转录变化的幅度
本文使用幼鼠（~5个月）和老龄鼠（~20个月，每个年龄组 n=4 个生物重复）的核提取物和三个20 bp的DNA寡核苷酸进行了寡核苷酸质谱分析（图4A）。火山图显示了老年鼠肝脏中5hmC链与输入对比的不同蛋白的丰度变化，显示5hmC结合的蛋白显著降低，主要涉及RNA剪切和mRNA加工（图4B-C）。GO分析显示与5hmC结合的蛋白主要富集在翻译、代谢和线粒体过程相关。使用rMATs和纳米孔测序，本文发现老年样本中高5hmC基因的选择性剪切明显增加，即随着年龄变化最小的基因；这基因表达变化较大的基因，即非5hmC富集基因，并没有显示出剪切事件增加（图4F-H）。因此，本文的数据表明RNA剪接在介导5hmC年龄相关转录限制功能中的潜在作用。
图4 选择性剪接通过减少剪接因子的结合介导5hmC的转录限制功能
RNA-seq数据显示，老年人和年轻人之间5hmC调节因子Tet1、Tet2和Tet3的mRNA水平无显著差异（图5A）。随后进一步研究了老年肝脏中TET活性是否改变，未发现显著差异（图5B）。这些结果表明，随着年龄的增长，5hmC的增加并不是同源酶丰度或活性的简单结果。作者通过两种方式诱导HepG2细胞系的静止：通过接触抑制（一种在二维上模拟非分裂器官状态的模型）和血清饥饿。作者检测到接触抑制诱导的静止状态下5hmC的显著增加（图5C），而不是血清饥饿，这表明超静止状态有助于5hmC的积累。此外，静止状态和VC处理均可显著影响ATP产生进而影响线粒体功能（图5F-G）。因此，与年龄相关的环境，如静止和衰老，或维生素C治疗，而不是ROS，可以增加5hmC并下调组织特异性功能。
图5 静止和衰老导致5hmC随年龄增长而增加，并影响ATP的产生
随后，作者对雌雄幼龄（~3 - 4个月）和老年（~20-22个月）小鼠进行了70%的部分肝切除术（图6A），并收集术前和术后48、72、96、120和240 h的肝脏样本，结果显示年龄和再生对相对全局5hmC水平的显著综合影响（图6B）。再生后，通过hMeDIP-seq测量的局部5hmC水平在基因体上显著降低（图6C），对于随着年龄增长表达变化最小的基因，这种影响尤为显著（图6D）。维生素C处理增加了所有hg19基因的5hmC（图6H）。总之，减少（肝脏再生）或增加（维生素C治疗）5hmC分别导致转录量的增加和减少，表明5hmC在调节年龄的转录变化中起着关键作用。
图6 改变5hmC水平会影响转录水平
最后，本文研究了5hmC的转录限制功能是否延伸到人类组织，探索在衰老组织中可能存在保守的表观遗传调控。作者分析了从基因型组织表达（GTEx）项目和两个已发表的人类5hmC数据集（hmC-CATCH-seq和5hmC- seal）中为相应组织挖掘了公开可用的人类RNA-seq数据（图7A）。与大脑特异性基因相比，衰老过程中大脑中转录发生显著变化的基因body区5hmC信号相对较低，只有一个样本例外（图7B）。在心脏和肝脏组织中，组织特异性基因中的5hmC水平明显高于差异基因（图7C和6D）。与差异基因相比，所有心脏和肝脏样本显示组织特异性基因中的5hmC水平明显更高（图7F-G）。总的来说，这些结果表明5hmC可能是老年哺乳动物组织中转录限制的共同调节因子，在心脏和肝脏中存在显著差异，在大脑中也存在较小程度的差异。
图7 人体组织也表现出5hmc介导的转录限制
综上所述，本文揭示了表观遗传修饰5hmC在衰老和代谢调控中的关键作用，揭示了5hmC在与组织特异性功能相关的基因body区的积累，并限制衰老引起的基因表达变化。这些发现为进一步理解表观遗传修饰在衰老中的功能提供了新的见解，且相关5hmC位点可能成为未来表观遗传学干预和治疗的潜在靶点。
文章编号：455
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-50725-y
原文引用：
James R Occean, Na Yang, Yan Sun, Marshall S Dawkins, Rachel Munk, Cedric Belair, Showkat Dar, Carlos Anerillas, Lin Wang, Changyou Shi, Christopher Dunn, Michel Bernier, Nathan L Price, Julie S Kim, Chang-Yi Cui, Jinshui Fan, Moitrayee Bhattacharyya, Supriyo De, Manolis Maragkakis, Rafael de Cabo, Simone Sidoli, Payel Sen*. Gene body DNA hydroxymethylation restricts the magnitude of transcriptional changes during aging. Nat. Commun., 2024, 15(1): 6357.
