供稿：曾黎，武汉大学
校稿：刘亚君，武汉大学
推送：刘亚君，武汉大学
今天给大家分享的文章发表在Journal of the American Chemical Society上，标题为Engineered Methionine Adenosyltransferase Cascades for Metabolic Labeling of Individual DNA Methylomes in Live Cells，通讯作者是维尔纽斯大学生物DNA修饰系的Saulius Klimašauskas教授。
甲基化是一个在自然界广泛存在的修饰现象，具有多种调节和结构功能。一般来说，甲基化的发生需要腺苷甲硫氨酸（AdoMet）和腺苷依赖的甲基转移酶（Mtases），而AdoMet由甲硫氨酸（Met）和ATP在多聚甲硫氨酸腺苷转移酶（MAT）的作用下形成。为了推进机制和功能研究，已经开发了重新利用MAT和MTase反应的策略。在本文中，作者将甲硫氨酸替换为N3基团修饰的甲硫氨酸（N3-Met）再使用MAT工程酶MAT2A，合成叠氮化腺苷甲硫氨酸（Ado-6-azide）。最后再使用DNMT1酶，利用基因组编辑的手段将DNA甲基化修饰，这样DNA就可以被叠氮所标记。本文首次利用了一种用于生物合成AdoMet类似物的遗传稳定系统，该系统能够在活哺乳动物细胞中温和地代谢标记DNMT特异性甲基化。
首先，作者通过小鼠MAT2A的结构导向工程，使甲硫氨酸类似物S-（6-叠氮基己基-2-炔基）-L-同型半胱氨酸（N3-Met）能够生物催化合成扩展的Ado-6-azide。接下来，作者利用Ribbon model模拟MAT2A反应复合体，对Q113,S114,I117三个残基改进以得到工程化MAT2A的三个变体（图1B）。而后作者使用液质联用系统的方法对三个变体进行表征，从其结果可以看出，I117A的反应速率最快（图1C，D）。由于细胞中往往N3-Met与Met同时存在，所以对于一连串的级联反应，对于酶的选择性也是考察的要点。作者通过使用液相色谱-串联质谱联用技术来确定突变体的稳态动力学参数来对于野生型和三种变体酶的选择性进行考察。发现相对于野生型而言，三种变体对于N3-Met都有较强的选择性。
图1 工程MAT2A用于增强甲硫氨酸类似物的催化活性
接下来，作者在N3-Met和不同摩尔比的Met直接竞争的条件下进一步评估了Q113N I117A，S114A I117A和I117A在体外的底物选择性。结果发现，I117A的选择性相对不好，但是在高浓度情况下，三者差别不大。同时，作者对其催化常数（图2A）与转化率（图2B）进行了测定。可以看出，I117A的催化常数与转化率在N3-Met含量100%的情况下是三个里面最高的。
图2 工程MAT2A变体对甲硫氨酸类似物的选择性
在下一步中，作者使用特殊的甲基转移酶（MTase）eDNMT1与M.TaqI进行相关的级联反应研究，该酶被证明能够与广泛的AdoMet类似物进行DNA标记。DNA修饰反应是通过染料DBCO-Cy5对N3基团进行标记来监测的。在这两种情况下，I117A变异体只观察到微弱的信号，Q113N I117A和S114A I117A相比野生型或者I117A的确有着更强的选择性，在具有内源性Met的情况下都检测出了信号（图3B，3C）。综上，本研究确定了两个MAT2A变体（Q113N I117A和S114A I117A），它们可以有效地在存在内源性Met的情况下实现级联反应并且成功标记DNA。
图3 使用甲基转移酶进行相关的级联反应研究
最后，作者对该级联反应在细胞内实施的一系列指标进行了测定（图4）。加入了S114A I117A酶对细胞的生存还是会有一点影响的，但是影响不大（图4A）。作者在细胞培养基中进一步添加0.5-2mM浓度的N3-Met，发现对细胞活力无明显影响，而加入S114A/I117A酶与2 mM的N3-Met并孵育24小时后，活性细胞数略有下降。因此，加入了S114A I117A酶对细胞的生存会有较小的影响。然后，作者使用液相色谱-串联质谱联用技术分析研究了m5C和N3-m5C的全基因组水平。尽管Met剥夺导致基因组m5C显著降低，但工程细胞显示出与天然细胞几乎相同的m5C水平，这表明单等位基因Mat2a替代实际上对DNA甲基化没有影响（图4B）。I117A虽然选择性不如S114A I117A，但是其可以得到更高的信号强度（图4C），随着培养时间的增加，信号明显增加（图4D）。而后作者又对加入的不同浓度N3对级联反应的影响进行了测定，随着浓度的升高，信号越明显（图4E）。为了验证DNA标记的特异性，作者使用TOP-seq technique技术对野生型和I117A代谢标记位点的接近程度进行测定，可见I117A有明显信号（图4F）。
图4 活胚胎干细胞中的基因组DNA代谢标记
综上所述，本文得到了三个优秀的工程化MAT2A变体Q113N I117A,S114A I117A，I117A以生物合成为Ado-6-azide，最终伴随一连串级联反应实现DNA上的叠氮-甲基化修饰。使用这种稳定无毒Met类似物的无创治疗为细胞、组织和整个生物体水平的表观遗传信号的体内研究提供了新的可能性，同时该方法原则上可以扩展到研究各种真核系统中其他的DNA，RNA或蛋白质甲基化途径。
文章编号：408
原文链接：
https://doi.org/10.1021/jacs.4c06529
原文引用：
Liepa Gasiulė, Vaidotas Stankevičius, Kotryna Kvederavičiu̅tė, Jonas Mindaugas Rimšelis, Vaidas Klimkevičius, Gražina Petraitytė, Audronė Rukšėnaitė, Viktoras Masevičius and Saulius Klimašauskas*. Engineered Methionine Adenosyltransferase Cascades for Metabolic Labeling of Individual DNA Methylomes in Live Cells. J. Am. Chem. Soc., 2024, 146, 18722−18729.
