供稿：郝莹，武汉大学
校稿：顾淑怡，武汉大学
推送：顾淑怡，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Nucleic Acids Research上，标题为3,N4-Etheno-5-methylcytosine blocks TET1-3 oxidation but is repaired by ALKBH2,3 and FTO，通讯作者是来自美国布朗大学的Sarah Delaney教授和美国金斯敦罗德岛大学的李德玉教授。
5-甲基脱氧胞苷（5mC）是调节哺乳动物细胞功能的主要表观遗传修饰。内源性脂质过氧化可将5mC转化为3,N4-乙烯-5-甲基胞嘧啶（ϵ5mC）。ϵ5mC在结构上类似于诱变类似物3,N4-乙烯胞嘧啶（ϵC），其在直接逆转修复（DRR）途径中被AlkB家族酶修复，并在碱基切除修复（BER）途径中被DNA糖基化酶切除。在本文中，作者检测了DRR和BER酶以及TET1-3（修饰5mC中5-甲基的酶）对ϵ5mC的活性。作者发现5mC的乙烯醇修饰阻断了TET1-3的氧化。相反，AlkB家族中的三个人类同源物ALKBH2,3和FTO能够将ϵ5mC修复为5mC，随后被TET1修饰为5-羟甲基胞嘧啶。作者也证明了ALKBH2可能修复MEF细胞中的ϵ5mC。另一个同系物ALKBH5不能修复ϵ5mC。此外，ϵ5mC不是BER糖基化酶SMUG1、AAG或TDG的底物。这些发现表明，由ALKBH2,3和FTO进行的DRR可以减少ϵ5mC在遗传学和表观遗传学中的有害作用，并可能与TET酶一起调节表观遗传学调节。
图1 ϵ5mC的化学结构和TET1-3/ALKBH2/3/FTO介导的相关烷基-DNA修饰的酶促反应的公认机制。
1. 5mC被TET1-3氧化
为了验证TET家族酶的酶活性，作者通过固相合成用5mC的亚磷酰胺制备了含有5mC的13聚体DNA寡核苷酸。纯化后，将含5mC的oligo与含有必要辅因子的TET1一起温育。通过高分辨率电喷雾电离飞行时间（ESI-TOF）质谱（MS）分析反应混合物。具有所有辅因子但不具有TET1的13聚体起始材料的MS分析显示在电荷状态下的m/z与理论值一致（图2A和表1）。对于5mC与TET1的酶促反应，MS结果显示了新的寡聚物包络，其在1951.8331处具有单同位素峰的m/z，这与含有5hmC的寡聚物的理论m/z值对应（图2B和表1）。在与TET1的反应和检测条件下，没有观察到连续的氧化产物5fC和5caC。然而，TET2和3显示5mC氧化成5hmC和5fC。
图2 含5mC和ϵ5mC的寡核苷酸的高分辨质谱及TET1和ALKBH2对它们的氧化。
表1 酶促反应中存在的寡核苷酸种类的计算和观察的单同位素分子量和m/z值
2.ϵ5mC被ALKBH2/3/FTO修复，而不是TET1/2/3
作者将含5mC的13聚体寡聚物用2-氯乙醛处理，产物寡聚物（含ϵ5mC）用HPLC纯化。纯化产物oligo的高分辨率MS分析显示其m/z与含oligo的ϵ5mC预期的理论m/z非常一致（图2C和表1）。在ϵ5mC与TET1-3的反应中，作者没有观察到任何氧化产物（图2D）：既没有在5-甲基上氧化生成5-羟基-ϵ5mC（ϵ5hmC，图1），也没有在乙烯桥上氧化生成ϵ5mC的环氧化物（图1）。另一方面，ϵ5mC被ALKBH2修复了。除了起始材料ϵ5mC（图2E），MS光谱中出现了三个新的峰包络（图2E）。这些结果表明ϵ5mC被氧化修复至5mC。ALKBH2修复ϵ5mC的反应机制类似于AlkB修复ϵA的反应机制，包括氧化乙烯双键形成环氧化物（图1），然后环氧化物水解生成乙二醇，乙二醇随后分解为未受损的碱和乙二醛（图1）。在m/z 1963.8182处的第三个峰值对应于等于ϵ5mC加上一个氧原子的种类。虽然该质量可能对应于ϵ5hmC或ϵ5mC的环氧化物（图1），但作者假设该物种是ϵ5mC的环氧化物，而不是ϵ5hmC的环氧化物。因为上面确定的产物5mC的产生可能通过ϵ5mC的环氧化物的形成进行；在AlkB对ϵA的氧化修复中观察到类似的环氧化物。其次，当用AlkBH2处理5mC时或在ϵ5mC和AlkBH2的反应混合物中（图2E），作者没有观察到5hmC，这表明在当前的反应条件下5-甲基没有被ALKBH2氧化。ALKBH3和FTO也能够将ϵ5mC修复至5mC，但不能氧化ϵ5mC中的5-甲基。另一种AlkB人类同源物ALKBH5对ϵ5mC没有表现出任何氧化活性。
图3验证HiFi Taq DNA连接酶和5hmC/a错配配对在SLim-PCR系统中的关键作用。
3. ALKBH2和TET1一起氧化ϵ5mC
作者将TET1和ALKBH2结合在一起对ϵ5mC进行反应。在质谱图（图2F）中，在m/z 1955.8225处观察到起始材料ϵ5mC，这与5mC+Na+部分重叠。另一个峰值出现在1951.8151，对应于5hmC。综上所述：（1）ϵ5mC中的乙烯基部分阻断了TET1对5-甲基的氧化（图1和2b）；（2）ALKBH2能够通过环氧化物和乙二醇将ϵ5mC修复到5mC，但不能氧化ϵ5mC中的5-甲基（图1和2E）；（3）在图2F中，ϵ5mC最初被ALKBH2转化为5mC（遗传修复），随后被TET1氧化为5hmC （图1）。因此，ALKBH2和TET1共同作用，将ϵ5mC转化为5hmC，从而克服了乙烯部分对TET1氧化5-甲基的阻碍。
4.缺乏ALKBH2的细胞中ϵ5mC水平较高
在发现ϵ5mC被ALKBH2生化修复后，作者接着研究了敲除ALKBH2对细胞中乙烯损伤的核碱基水平的影响。用0.1% DMSO中不同浓度的CAA （0.0、62.5和125.0微米）处理野生型（WT）和ALKBH2敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞。使用三重四极杆液相色谱上的动态多反应监测（dMRM）对生成的乙烯脱氧核糖核苷ϵA和ϵ5mC进行定量。结果表明，在WT和ALKBH2细胞中暴露于不同浓度的CAA后，ϵA的水平是剂量依赖性的（图3A）。在所有CAA浓度下，ALKBH2细胞中的ϵA水平在统计学上均高于WT细胞（图3A）。这些结果表明，ALKBH2有效地修复了MEF细胞中的ϵA，这与先前发表的观察结果一致。使用类似的方法，用m/z 266.1的前体离子和m/z 150.0的产物离子检测在4.559分钟洗脱的ϵ5mC。与ϵA一样，在WT和ALKBH2细胞中暴露于CAA后，ϵ5mC的水平也是剂量依赖性的（图3B）。与所有浓度的CAA下的WT细胞相比，ALKBH2/细胞中的ϵ5mC水平显著增加（图3B）,表明ALKBH2蛋白可能修复MEF细胞中的ϵ5mC。
图4 对暴露于0.1% DMSO中不同浓度的CAA的野生型和ALKBH2敲除MEF细胞中的乙烯脱氧核糖核苷进行定量，并在三重四极杆LC/MS上通过动态MRM分析进行分析。
5. BER糖基化酶不能修复ϵ5mC
作者分析了三种DNA糖基化酶从ds-DNA上切除ϵ5mC损伤的能力：TDG、SMUG1和AAG，这些糖基化酶都没有显示出切除ϵ5mC的活性（图4）。用APE1处理糖基化酶反应，增强了一些DNA糖基化酶的活性，也没有导致可观察到的ϵ5mC的切除。相比之下，测试的糖基化酶显示了对其他报道的底物的预期活性；当与G配对时，TDG切除了U、ϵC和T，但没有切除C；当与G配对时，SMUG1切除了U和ϵC而不是C；AAG从ϵA:T对中切除了ϵA，但是在C:G对中没有显示出活性（图4）。这些结果表明ϵ5mC不可能是BER的底物。
在本工作中，作者利用化学和生物化学方法研究了DRR、BER和TET1-3酶对ϵ5mC的修复作用。作者发现ϵ5mC阻断了TET1-3的氧化，但被ALKBH2，3和FTO修复。ϵ5mC还阻断BER糖基化酶如TDG的活性，TDG去除活性去甲基化途径中的5fC和5caC中间体，ALKBH2可以修复MEF细胞中的ϵ5mC（图3）。这些发现为将来研究ϵ5mC's对遗传学和表观遗传学的生物效应提供了基础。阻断5mC氧化和随后的去甲基化以及ϵ5mC在体内对复制的任何影响都值得研究。
文章编号：433
原文链接：
https://doi.org/10.1093/nar/gkae818
原文引用：
Jian Ma, Rui Qi, Emily M. Harcourt, Yi-Tzai Chen, Giovannia M. Barbosa, Zhiyuan Peng, Samuel Howarth, Sarah Delaney*, Deyu Li*. 3,N4-Etheno-5-methylcytosine blocks TET1-3 oxidation but is repaired by ALKBH2,3 and FTO. Nucleic Acids Res., 2024. DOI:10.1093/nar/gkae818.
