供稿：余思宇，武汉大学
校稿：曾黎，武汉大学
推送：曾黎，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Journal of Hazardous Materials上，标题为Polystyrene nanoplastics induce lipophagy via the AMPK/ULK1 pathway and block lipophagic flux leading to lipid accumulation in hepatocytes，通讯作者是首都医科大学公共卫生学院毒理与卫生化学系的王继教授。
微塑料和纳米塑料污染已成为全球关注的一个重大问题，因为它们广泛存在于环境中，对人类健康有潜在的不利影响。纳米塑料可以进入人体循环系统并在肝脏中积累，破坏肝脏代谢并引起肝毒性。然而，确切的机制仍然不确定。脂噬是脂质代谢的另一种机制，涉及自噬。本研究旨在探讨聚苯乙烯纳米塑料(PSNPs)如何通过脂质吞噬影响肝细胞的脂质代谢。最初，人们发现PSNP被人肝细胞内化，导致细胞活力下降。纳米塑料由于其纳米颗粒的特性，可能比微塑料更危险。它们可以更容易地穿透生物屏障并进入生物体。经PSNP处理的人和小鼠巨噬细胞可导致脂滴(LD)积聚。然而，很少有研究探讨纳米塑料引起脂质代谢紊乱的潜在机制，作者团队证明出，PSNP通过AMPK/ULK1途径触发脂噬，阻断脂噬通量，导致肝细胞脂质积累。
脂噬被认为是一种调节脂质代谢的新机制。它是一种选择性自噬，降解细胞内LD，产生游离脂肪酸(FFAs)，游离脂肪酸被线粒体β氧化产生腺嘌呤核苷三磷酸（ATP），有助于维持细胞能量稳态。脂噬功能障碍是由于脂噬过度激活、脂噬通量受阻或两者兼而有之导致自噬体异常增加所致。
图1 PSNPs诱导脂质积累潜在机制的示意图模型
采用透射电镜对直径分别为50 nm、100 nm和200 nm的PSNPs进行形貌和形状表征。透射电子显微镜 (TEM)图像显示，所有PSNPs具有相对均匀的球体，并且分散良好(图2A)。三种PSNP的平均直径分别为49.12±5.45 nm、99.62±6.74 nm和198.98±7.38 nm(图2B)。
这些数据表明，本研究中使用的三种大小的PSNPs在蒸馏水和DMEM中都具有良好的稳定性和单分散性。由于PSNP的细胞内化直接影响其生物学和毒理学反应，因此使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察它们在细胞内的分布。LSCM图像显示，处理24 h后，人正常肝细胞（L-02）吸收了红色荧光标记的PSNP。随着PSNP剂量的增加，肝细胞内内化PSNP的数量也增加(图2C)。因此，PSNP可以内化到肝细胞中。
图2 聚苯乙烯纳米塑料的表征及其细胞内化
作者团队用不同剂量的50 nm、100 nm和200 nm PSNPs处理L-02细胞24小时。数据显示，所有三种尺寸的PSNPs都以剂量依赖的方式降低细胞活力，50 nm的PSNPs比其他两种尺寸的PSNPs毒性略大(图3A)。ROS的产生可以作为PSNP的细胞毒性指标。流式细胞术检测表明，随着处理剂量的增加，这三种大小的PSNPs都能刺激L-02细胞产生更多的ROS(图3B)。在接下来的实验中，作者团队选择了50 nm的PSNP作为纳米塑料的代表进行研究。
图3 PSNPs的细胞毒性
Bodipy染色图像显示，PSNPs以剂量依赖的方式增加了L-02细胞中LD的积累(图4A)。脂肪分化相关蛋白（PLIN2）是唯一的组成表达蛋白，已被用作LD的标记物。Western blot检测证实PLIN2的表达随着PSNP处理剂量的增加而增加(图4B)。为了验证自噬在PSNP诱导的LD积累中的作用，作者团队使用了自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)（图4C和D），3-MA处理导致PSNP诱导的bodipy染色LD聚集和PLIN2表达增加。因此，作者团队可以得出结论，自噬作用在暴露于PSNP时肝细胞内LD的积累中起作用。
图4 PSNPs通过自噬途径诱导LD积累
为了证实PSNPs诱导的脂噬激活，作者团队进行了Western blot和免疫荧光实验。在PSNP处理的L-02细胞中，微管相关蛋白 1 轻链 3 beta（LC3B-II）的表达呈剂量依赖性增加。此外，PSNP处理的细胞与未处理的对照细胞之间螯合体1（p62）的表达无显著差异。p62蛋白的不降解表明自噬通量可能被阻断(图5A)。LSCM图像显示，在细胞质中PSNP处理后，LC3B的分布以剂量依赖的方式集中在点状细胞中(图5B)。此外，LSCM分析显示，在不同剂量的PSNP处理的细胞中，LD与自噬体膜蛋白LC3B和溶酶体膜蛋白LAMP1共定位。这表明PSNP促进了LD向自噬体和自溶体的传递(图5C)。这些发现表明PSNP激活了肝细胞的脂质吞噬。
图5 PSNP触发L-02细胞脂噬
作者团队通过使用空泡型H+- atp酶(VATPase)特异性抑制剂巴菲霉素A1 (BafA1)来抑制自噬体与溶酶体的融合，通过Western blot检测PSNP处理细胞和对照细胞中LC3B和p62的积累。在PSNP处理组中，p62和LC3B在低剂量PSNP处理组与BafA1预处理组中聚集，而高剂量PSNP处理组与未进行BafA1预处理组相比未观察到明显的聚集(图6A)。结果表明，PSNPs在高剂量下可能抑制脂噬通量，但在低剂量下作用不大。为了进一步验证这一假设，作者团队使用mRFP-GFP-LC3B慢病毒来证实PSNP诱导的脂溶性通量的阻断。随着PSNP处理剂量的增加，合并图像中黄点和红点的数量也显著增加（图6B）。这表明PSNPs引起了脂溶性通量的阻塞，特别是在高剂量下。然后用溶酶tracker染色检测PSNP对溶酶体的影响。图像显示，随着PSNP处理剂量的增加，红色荧光减弱，提示PSNP对溶酶体造成损伤(图6C)。这些数据表明，PSNPs损害溶酶体功能，导致脂溶性通量受阻。
图6 PSNPs通过破坏溶酶体阻断脂噬通量
在PSNP处理后，单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）和UNC-51 样激酶 1（ULK1）的磷酸化水平以及下游苄氯素1（Beclin1）的表达呈剂量依赖性增加（图7A）。这表明AMPK/ULK1通路被激活。为了验证PSNP是否通过AMPK/ULK1途径诱导脂肪吞噬，作者团队进行了AMPK siRNA转染。在PSNP处理组中，与未敲除AMPK的组相比，转染AMPK siRNA的高剂量PSNP处理组AMPK和ULK1的磷酸化水平均降低。此外，下调AMPK后也证实了自噬标志物LC3B和Beclin1的表达降低(图7B)。此外，Bodipy染色图像显示LD堆积下调AMPK后，L-02细胞中PSNPs诱导的PSNPs效应加剧(图7C)。同时，Western blot检测证实，LD膜蛋白PLIN2的表达进一步增强(图7D)。总的来说，作者团队的研究结果表明PSNP通过AMPK/ULK1途径激活脂噬，促进脂质积累。
图7 PSNP通过AMPK/ULK1途径诱导脂质吞噬，促进脂质积累
本研究发现PSNP可引起肝细胞内LD的积累，说明微塑料和纳米塑料污染是导致NAFLD的重要环境因素。因此，控制微塑料和纳米塑料污染是调节非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)进展的潜在策略。此外，作者团队的研究表明，脂噬在介导纳米塑料引起的肝细胞内LD的积累中起着至关重要的作用。因此，靶向脂肪吞噬可能是治疗NAFLD的一种潜在干预方法。
文章编号：423
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.134878
原文引用：
Zhuying Fan#, Yukang Zhang#, Yuting Fang, Huiyuan Zhong, Tingting Wei, Huraira Akhtar, Jiahuai Zhang, Man Yang, Yanbo Li, Xianqing Zhou, Zhiwei Sun, Ji Wang*. Polystyrene nanoplastics induce lipophagy via the AMPK/ULK1 pathway and block lipophagic flux leading to lipid accumulation in hepatocytes. J. HAZARD. MATER., 2024, 476:134878.（#为共同第一作者）
