供稿：张杉，武汉大学
校稿：顾淑怡，武汉大学
推送：顾淑怡，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Nucleic Acids Research上，标题为Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase，通讯作者是吉林大学的赖良学教授、李占军教授和隋婷婷副教授。
5-甲基胞嘧啶（m5C）是一种丰富的RNA修饰物，在调节RNA命运和基因表达中起着至关重要的作用。NOL1/NOP2/SUN结构域(NSUN)蛋白家族的成员和DNA甲基转移酶(DNMT)的同源物DNMT2可以促进RNA的甲基化，形成m5C。其中NSUN6是一种甲基转移酶，对mRNA具有很强的底物特异性，在tRNA和mRNA的CUCCA序列基序中催化甲基从S -腺苷蛋氨酸转移到胞嘧啶。相比之下，NSUN2表现出更广泛的底物特异性，主要甲基化mRNA，大部分tRNA和部分非编码RNA。与m5C修饰蛋白相反的是10 - 11易位2 (Tet2)酶和双加氧酶ABH1 (ALKBH1)负责去除RNA中的m5C。本文开发了一种基于CRISPR-Cas13d的编辑系统，名为重编程m5C修饰系统（reengineered m5C modification system，简称RCMS），用于特定RNA中的靶向m5C甲基化和去甲基化。
作者首先将m5C甲基化酶NSUN2/NSUN6或去甲基化酶Tet2 催化区与来自黄瘤球菌XPD3002的催化无活性Cas13d变体(RfxCas13d，dCasRx)融合在一起，安装或去除gRNA目标位点上的m5C(图1A和B)。作者首先确定了dCasRx-dNSUN6可以在细胞内正常表达，随后选择gRNA−150 nt来评估dCasRx-NSUN6编辑器在RPSA转录本m5C234位点的去修饰效率(图1C)。dCasRx-NSUN6编辑器诱导的RPSA mRNA中m5C234处的m5C修饰水平显著增加，转录本和蛋白水平也明显上调(图1E-G)。此外，m5C修饰率的升高导致RPSA转录本的半衰期显著增加(图1H)，因此，dCasRx与甲基转移酶的融合可以选择性和有效地在人细胞内的外源RNA中引入m5C修饰。
图1. NSUN6在HEK293T细胞中可编程位点特异性m5C编辑器活性的验证。
随后作者通过将人的NSUN2与dCasRx融合，构建了编码dCasRx-NSUN2和dCasRx-dead的NSUN2 (dCasRx- dnsun2)的质粒(图2A-B)，进一步以可编程的方式验证位点特异性安装m5C。为了进一步证实dCasRx-NSUN2在HEK293T细胞内源性转录本上引入m5C修饰的潜力，作者选择了KAT7上m5C 563位点作为验证位点(图2C)。此外，dCasRx-NSUN2在有gRNA引导时显著提高了KAT7的m5C水平(分别提高了1.5倍)(图2E)，且上调了KAT7 mRNA和蛋白的表达水平(图2F和G)。此外，dCasRx-NSUN2编辑器明显提高了KAT7转录本的稳定性(图2H)。综上所述，这些结果表明RCMS dCasRx-NSUN2编辑器有效地增加了靶RNA位点的m5C甲基化。
图2. NSUN2在HEK293T细胞中可编程位点特异性m5C编辑器活性的验证。
为了构建去除m5C的编辑器，本文将小鼠Tet2的催化结构域与dCasRx融合，将TRAF7 mRNA编码区的m5C1683位点作为编辑位点(图3A-C)。转染后，TRAF7 C1683位点的m5C水平显著下降了约15%(图3E)。随着m5C的去除，细胞中mRNA和蛋白的表达水平均显著降低(图3F和G)。当TRAF7 gRNA受dCasRx-Tet2CD编辑器影响时，TRAF7 mRNA的稳定性降低(图3H)。为了用其他内源性靶向转录物进一步验证这些结果，作者将BBS4编码区内的m5C808作为目标(图3I)，该区域含有大量甲基化位点。与上述结果一致，本文检测到dCasRx-Tet2CD以依赖于有效靶向BBS4的gRNA的方式降低了BBS4甲基化，同时mRNA表达水平、蛋白表达水平和mRNA稳定性降低(图3J-N)。因此，这些结果表明dCasRx-Tet2CD编辑器可以以可编程的方式去除特定位点的m5C。
图3. TET2在HEK293T细胞中可编程位点特异性m5C编辑器活性的验证。
随后作者开始在tRNA上验证RCMSs编辑器的能力。首先作者构建了NSUN2敲除的细胞系，再利用dCasRx-NSUN2质粒的靶向gRNA共转导到NSUN2 - / -细胞系中（图3A-D）。在gRNAs和dCasRxNSUN2编辑器的作用下，m5C39和m5C48的甲基化水平显著增加了~ 25%(图4G和H)。然而，在tRNAVal的m5C49位点，gRNA1而不是gRNA2的甲基化水平增加，后者位于目标位点(图4I)。为了进一步证明RCMS编辑器的去修饰的能力，本文的下一个目标是确定Tet2 CD是否可以靶向不同类型的RNA。因此，作者选择了tRNAVal和tRNALys两种不同的tRNA进行研究(图4E和M)。结果表明，位于tRNAVal m5C位点的gRNA可以有效地使dCasRxTet2 将tRNA去甲基化，其中gRNA1比tRNAVal中的gRNA2具有更高的效果(图4J-L)。同样，带有gRNA1的RCMS编辑器dCasRx-Tet2 在tRNALys中显示出有效性，这两种gRNAs在tRNALys中都显示出甲基化程度的降低(图4N和O)。总的来说，本文开发的RCMS编辑器可以诱导tRNA中m5C水平的安装和去除。
图4. RCMSs在tRNA水平上对m5C的修饰和去修饰能力
作者还评估了RCMSs的脱靶率，发现细胞内非靶m5C位点的mRNA表达水平没有任何变化，表明RCMSs对转录本的脱靶风险较低。此外BS-seq的结果也显示在RNA甲基化在转录组中的总体分布产生很小的脱靶效应。本文用RPSA CDS内的靶m5C234作为目标靶点，评估dCasRx-NSUN6在HepG2的编辑能力。转染后作者观察到甲基化水平显著增加(图5A)。相反，dCasRx-NSUN6编辑诱导的m5C修饰显著上调了相关的mRNA和蛋白质水平(图5B-C)。为了证实m5C编辑的影响是通过降解变化介导的，作者评估了mRNA的稳定性，发现m5C水平增加mRNA稳定性增加 (图6D)。随后，作者使用CCK8检测了细胞增殖的潜在变化。结果表明，dCasRx-NSUN6编辑器和靶向gRNA诱导的甲基化水平越高，细胞增殖越快(图6E)。此外，伤口愈合实验显示，与非靶向gRNA或dCasRx-dNSUN6靶向gRNA处理的细胞相比，dCasRx-NSUN6靶向gRNA处理的细胞伤口愈合显著增加(图6F和G)。这些数据表明，RCMS介导的m5C甲基化有助于稳定靶RNA，并随后影响细胞增殖和迁移过程。相反，使用dCasRx-TET2后甲基化水平明显降低，mRNA表达和蛋白水平下降，去除m5C导致mRNA降解加速，导致mRNA水平下降。总之，使用RCMSs能有效地编辑特定位点的m5C修饰。
图5. 使用RCMS dCasRx-NSUN6编辑器对HepG2细胞中的RPSA m5C位点进行修饰。
综上所述，本文开发了一种全新的 RNA中m5C编辑器，并探讨了其潜在的应用性，证明了RCMS的广泛功能。这标志着RCMS作为靶向表观转录组工具开创性的建立，允许在各种RNA靶标上精确地安装或去除特定位点的m5C。
文章编号：436
原文链接：
https://academic.oup.com/nar/article/52/6/2776/7608824?searchresult=1
原文引用：
Tao Zhang#, Feiyu Zhao#, Jinze Li#, Xiaodi Sun, Xiyun Zhang, Hejun Wang, Peng Fan, Liangxue Lai*, Zhanjun Li*, Tingting Sui*. Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase. Nucleic Acids Res., 2024, 52(6), 2776–2791. (#为共同第一作者)
