供稿：岗方印，武汉大学
校稿：胡秋霜，武汉大学
推送：胡秋霜，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Cell上，标题为RNA G-quadruplexes form scaffolds that promote neuropathological a-synuclein aggregation，通讯作者为日本熊本大学（Kumamoto University）基因组神经学系分子胚胎学和遗传学研究所的Norifumi Shioda和Yasushi Yabuki教授。
α-突触核蛋白病是一类神经退行性疾病的统称，包括帕金森病（PD）、路易体痴呆（DLB）和多系统萎缩（MSA）等，其病理特征是α-突触核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）在受损神经元中异常聚集，进而引发广泛的运动和非运动临床症状。然而，细胞内α-Syn的异常聚集机制仍不清楚。RNA G-四链体（rG4s）是由富含鸟嘌呤碱基（G）的序列形成的一类非经典RNA高级结构，在转录本中广泛存在，其可以通过调控RNA剪切、转运和翻译等过程调节基因表达，参与多项生命活动和疾病的发生发展。在此文中，作者推测rG4s可能在α-Syn聚集中发挥作用，从而导致神经退行性病变。
首先，作者通过人类α-突触核蛋白预制纤维（hPFF）处理小鼠皮质神经元细胞，诱导细胞中可溶性蛋白形成聚集体，并利用α-Syn抗体分析α-Syn的聚集情况。结果表明，随着时间的增加，α-Syn在细胞质中聚集以及α-Syn129位丝氨酸的磷酸化水平（pS129，磷酸化水平增加是突触核蛋白病的病理标志）增加（图1A和1B）。随后，通过光漂白后荧光恢复（FRAP）实验观察α-Syn在hPFF处理前后的动态变化，发现随着时间的增加荧光恢复明显降低，说明α-Syn的流动性降低且越来越聚集。作者还发现α-Syn聚集体可以与一些RNA结合蛋白（RNP）共定位。先前的研究表明，许多与神经退行性疾病相关的内源性无序蛋白可通过液-液相分离（LLPS）介导的溶胶-凝胶相变进行聚集，由此作者推测含有RNA和/或蛋白质可能为α-Syn的聚集提供支架。通过额外添加细胞源性RNA降低了α-Syn发生LLPS所需的聚乙二醇浓度，并且引发了液滴到凝胶状态的转变（图1D）。此外，通过荧光成像发现这些凝胶状聚集体中含有α-Syn。在存在RNA的FRAP实验中也证实了α-Syn在液滴状态下荧光恢复更快，而在凝胶状态下没有明显变化（图1E）。以上结果说明a-Syn与RNA的结合促进了其相分离，并形成凝胶状结构。随后，作者利用重组α-Syn和随机的24-nt RNA进行了RNA Bind-n-Seq分析，结果发现α-Syn显著结合的RNA基序是富含G的序列，并且这些基序需要连续而非随机的G序列（图1F），从而说明rG4s可能是α-Syn的潜在结合结构。为了进一步验证α-Syn是否优先与rG4s相互作用，作者运用不同的RNA寡核苷酸结构进行了电泳迁移实验，结果发现α-Syn仅对rG4s形成的典型序列（G4tr）和G连续序列具有高亲和力，对其他RNA结构几乎没有亲和力（图1G）。对于体外α-Syn的LLPS，G4突变序列（G4mt）在15% PEG存在下对α-Syn液滴形成没有影响，而G4tr则增强了α-Syn向凝胶状态的转变（图1I）。
接下来，作者研究了细胞内rG4s诱导α-Syn聚集的机制。结果显示，Ca2+可以在体外促进rG4s发生LLPS，并发现在Ca2+的存在下，G4tr与α-Syn共聚集形成凝胶状结构，加入Ca2+螯合剂EGTA后，凝胶状结构消失（图2A）。在没有G4tr的情况下，无论Ca2+是否存在，都没有观察到α-Syn液滴或凝胶状聚集体（图2A）。FRAP结果表明，Ca2+促进G4tr和α-Syn凝聚成凝胶状，显著降低FRAP的荧光信号强度，加入EGTA后，信号强度恢复（图2B）。Proteostat荧光染料可以特异性结合聚集蛋白，发出荧光信号，在Ca2+存在下，G4tr和α-Syn聚集体的信号强度显著增加。以上结果进一步证实了Ca2+的诱导是rG4s促进α-Syn聚集的必要条件（图2C）。随后，作者利用BG4（G4的特异性抗体）通过免疫荧光检测Ca2+诱导的rG4s组装是否在神经元中观察到，与对照组相比，mPFF（α-Syn预制纤维）或Ca2+处理显著增加了胞质中G4的数量（图2D）。此外，作者还发现在培养的神经元、突触核病模型小鼠以及PD患者的脑干中，pS129阳性的α-Syn与rG4s广泛共定位，但不与双链RNA共定位（图2E-2G）。图2 Ca2+触发rG4s诱导α-Syn溶胶-凝胶相转变
为了证实rG4s作为神经元中α-Syn聚集的支架，作者通过RNA免疫沉淀测序（BG4 RIP-seq和pS129 RIP-seq）分析mPFF处理后小鼠神经元中BG4结合的RNA以及pS129阳性α-Syn共聚集的RNA（图3A）。将这些RNA取交集后，分析其功能和富集的生物学途径，结果发现富集了许多编码突触蛋白的mRNA（图3A-3D），如Camk2a和Dlg4已被生物物理实验证实可形成G4结构，可能会导致相应蛋白表达水平下降和突触功能障碍。此外，mPFF处理后的小鼠神经元中观察到Camk2a和Dlg4的mRNA在细胞质和神经轴突中与pS129阳性的α-Syn高度共定位（图3G、3H）。图3 富含rG4s的突触mRNAs参与α-Syn的聚集
为了直接验证rG4s组装引发α-Syn聚集，作者开发了基于蓝光（BL）刺激下诱导rG4s组装的光遗传学系统（optoG4）（图4A）。在BL刺激下，诱导共表达optoG4和α-Syn的神经元细胞中的rG4s组装（图4B），并且α-Syn与rG4s形成聚集体（图4C）。在BL刺激下，表达optoG4系统的小鼠神经元中内源性的α-Syn与rG4s形成聚集体（图4D）。随后，作者通过测量自发兴奋性突触后电流来研究optoG4诱导的α-Syn聚集对神经元活动的影响。与未受刺激的神经元相比，BL刺激下表达optoG4的神经元电流的振幅和频率显著降低（图4F），以上结果说明在BL刺激下，rG4s组装诱导α-Syn聚集和神经元活动障碍。图4 optoG4诱导的α-Syn聚集引发细胞神经元功能障碍
此外，作者还在小鼠黑质多巴胺能神经元中表达optoG4系统（图5A），在BL刺激下诱导rG4s与α-Syn共聚集（图5B）。在BL刺激下，表达optoG4的小鼠与未受刺激的小鼠相比，TH阳性的多巴胺能神经元的数量显著减少（图5C）。随后，通过旋转杆和光束行走试验来确定optoG4系统是否诱导PD样运动缺陷，与未受刺激的小鼠相比，BL刺激的OptoG4小鼠在旋转杆试验中跌倒潜伏期显著减少、光束行走试验中脚步次数增加，表明小鼠的运动协调和平衡能力显著受损（图5D）。最后，为了阐明由optoG4引起的神经变性和运动功能障碍是否通过α-Syn聚集介导，作者在α-Syn基因敲除（α-Syn-/-）小鼠中表达optoG4系统。经BL刺激后，表达OptoG4的（α-Syn-/-）小鼠中，TH阳性的多巴胺能神经元数量的减少得到了改善，同时也没有表现出运动功能障碍（图5D）。以上结果说明，rG4和内源性α-Syn的共聚集导致多巴胺能神经变性和运动功能障碍。图5 optoG4诱导的α-Syn聚集引发小鼠神经退行性变
综上，本研究发现在Ca2+存在下，rG4与α-Syn共聚集，其可能成为突触核蛋白病的诊断标志物。将离子稳态失衡、RNA代谢异常和蛋白质聚集等多个病理过程联系起来，有助于更全面地理解神经退行性疾病的发病机制。通过干预rG4s的形成，可能有助于阻止或减缓α-Syn的病理性聚集，从而为治疗神经退行性疾病提供新思路。
文章编号：446
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424011346
原文引用：
Kazuya Matsuo, Sefan Asamitsu, Kohei Maeda, Hiroyoshi Suzuki, Kosuke Kawakubo, Ginji Komiya, Kenta Kudo, Yusuke Sakai, Karin Hori, Susumu Ikenoshita, Shingo Usuki, Shiori Funahashi, Hideki Oizumi, Atsushi Takeda, Yasushi Kawata, Tomohiro Mizobata, Norifumi Shioda*, Yasushi Yabuki*. RNA G-quadruplexes form scaffolds that promote neuropathological α-synuclein aggregation. Cell, 2024. DOI: 10.1016/j.cell.2024.09.037.
