供稿：郝莹，武汉大学
校稿：郝莹，武汉大学
推送：郝莹，武汉大学
1 Slim-PCR检测的原理
图1 HiFi Taq DNA连接酶辅助SLim策略用于选择性鉴别和检测位点特异性5hmC的示意图
2 评估连接酶和探针的选择性
在本研究中，HiFi Taq DNA连接酶对5hmC/A错配的选择性识别和耐受性特征是SLim设计的关键，作者首先探究了Down Probe和Up Probe（A，C，T，G）的连接效率，将X-相对碱基分别改变为A，C，T或G。使用Up Probe-A检测含C类似物的SLim-PCR系统的PAGE结果如图2a所示。可以看出，只有5hmC显示出明显的PCR产物条带，而空白对照、C或5mC的PCR产物可以忽略不计。如果HiFi Taq DNA连接酶不存在，则5hmC引起的条带消失。此外，当Up Probe-A被Up Probe-G、或-T、或-C取代时，如图2b-d所示，5hmC获得的结果与C/5mC产生的结果没有明显区别。图2a-d中的所有这些结果清楚地证明了5hmC/A错配与HiFi Taq DNA连接酶的合理组合形成了SLim有效区分5hmC与C和5mC的基础。然后，作者进一步评估了HiFi Taq DNA连接酶在耐受5hmC/A错配中的关键作用。从图2a、f-j中可以看出，在使用Up Probe-A的情况下，只有HiFi Taq DNA连接酶对5hmC具有高选择性，只有基于SLim的连接产物可以启动LAMP扩增。如图3b所示，SLim-LAMP结果的PAGE结果与通过SLim-PCR获得的结果非常一致。从图3b可以看出，只有5hmC产生明显的梯状DNA条带（LAMP产物的特征模式），而5C或5mC不能启动连接和随后的LAMP，这与SLim-PCR的结果几乎相同。总之，Up Probe-A和HiFi Taq DNA连接酶的组合是特异性5hmC与其类似类似物区分的最佳选择，并且5hmC特异性SLim策略可以灵活地与各种连接辅助的高效核酸扩增技术组合以提高检测灵敏度。
图2 验证HiFi Taq DNA连接酶和5hmC/ a错配配对在SLim-PCR系统中的关键作用
图3 （a） SLim-LAMP 5hmC实验示意图。（b）空白、200 fM C靶、5mC靶和5hmC靶制备的SLim-LAMP产品凝胶电泳
3 SLim-PCR检测的分析性能
图4 位点特异性5hmC分析的SLim-PCR分析性能
4 评估SLim-PCR检测的特异性
图5 （a） 5hmC、C和5mC制备的SLim-PCR体系实时荧光曲线、（b） 5hmC与C总浓度为2pm的混合物中，5hmC在不同比例下的实时荧光曲线、（c） CT与5hmC-target混合物中5hmC-target浓度（%）的lg的关系
5 基因组DNA中位点特异性5hmC检测
文章编号：419
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https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c02621
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