供稿：谢何曦，武汉大学
校稿：冯甜，武汉大学
推送：冯甜，武汉大学
今天给大家分享的文献是发表在Environmental Science&Techonology上的文章，标题是Short Chain Chlorinated Paraffins Impaired Spermatogenesis Process in Mice via Inhibiting α‑KG/TET Enzyme Activity，北京市职业病防治研究所中心实验室的刘晓东和郑州大学公共卫生学院的张慧珍教授为共同通讯作者。
短链氯化石蜡（SCCPs）是一组碳链长度为10-13的多氯代烷烃，常用作塑料制品的增塑剂、阻燃剂等。SCCPs在环境中普遍存在，人类主要通过饮食摄入，且远高于WHO关于致癌作用的可接受每日摄入量，对人体健康构成潜在威胁。目前有研究表明SCCPs会影响精子质量，但关于SCCPs对男性生殖系统的毒性机制尚不清楚。
本研究将雄性BALB/c小鼠分为对照组和不同剂量的SCCPs处理组，观察SCCPs对小鼠体重、睾丸指数、性激素水平、氧化应激标志物、精子参数等的影响。通过GC-1细胞模型的应用，评估细胞活力、氧化应激、三羧酸循环（TAC）代谢、易位羟化酶（TET）活性等。旨在为探究SCCPs对雄性小鼠生殖毒性及其分子机制的影响提供理论依据。
图1A中不同剂量SCCPs处理后小鼠体重变化结果显示，小鼠体重的增加幅度随SCCPs剂量的增加而减少，尤其是高剂量SCCPs处理的小鼠体重增加量显著低于对照组（图1B）。SCCPs处理后小鼠的睾丸指数也逐渐下降（图1C）。图1D显示SCCPs暴露显著降低了睾酮和促卵泡生成素（FSH）的水平，而图1E显示SCCPs暴露显著增加了活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的水平，降低了谷胱甘肽（GSH）的水平。在精子的数量与活力方面，使用苏木精-伊红（HE）染色、伊红黑素染色以及计算机辅助分析程序进行检测，发现SCCPs暴露导致睾丸组织结构受损与精子活力下降（图1F-J）。
图1 SCCPs暴露对雄性小鼠生殖系统的影响
在SCCPs对小鼠睾丸基因表达影响的分子层面上，作者利用火山图来直观展示转录组基因表达相比于对照组上调（右侧）和下调（左侧）的倍数变化（图2A）。利用EuKaryotic Orthologous Groups和Gene Ontology数据库对差异表达基因进行功能富集分析，揭示了差异表达基因（DEGs）主要生物学过程（图2B-C）。而维恩图展示了与精子发生相关的DEGs，热图则进一步显示了DEGs的具体表达模式（图2D-E）。接着作者使用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络图谱来探究精子发育过程中关键基因之间的相互作用关系，结果显示这些基因的表达受到SCCPs的影响（图2F）。最后通过qPCR验证RNA-seq结果中关键基因的表达变化，发现qPCR结果与RNA-seq结果一致，从而验证了RNA-seq数据的可靠性。
图2 SCCPs暴露对小鼠睾丸转录组的影响
在SCCPs对小鼠精子发育过程影响的细胞层面上，免疫荧光图像显示了SCCPs暴露后精原细胞和精母细胞数量减少（图3A）。流式细胞术分析表明，SCCPs暴露导致精原细胞向精母细胞转化过程受阻（图3B-D）。蛋白质印迹分析结果显示与精子发生相关的蛋白表达水平降低（图3E）。以上证据显示SCCPs可能通过干扰精原细胞的增殖和分化，损害精子的发育。
图3 SCCPs暴露对小鼠的精子发育过程的影响
接着作者测定了小鼠睾丸中α-KG/TET酶活性及精子发育相关基因的表达水平。SCCPs暴露导致高剂量组中TCA代谢物水平显著降低，表明SCCPs可能抑制了TAC代谢（图4A）。使用qPCR检测TAC相关基因的表达情况，发现SCCPs暴露显著降低了TAC代谢酶的mRNA水平，这与代谢物水平的变化相一致（图4B）。通过比色法检测发现TET酶活性降低（图4C）。斑点杂交和免疫组织化学检测结果显示5hmC水平降低，5mC水平升高，SCCPs可能通过抑制TET酶活性来增加DNA甲基化（图4D-E）。SCCPs暴露导致精子发生相关基因（如Rbm46、Sohlh1、Kit和Dmrt1）的启动子甲基化水平显著升高（图4F），这可能是它们表达降低的原因之一。
图4 SCCPs对ɑ-KG/TET酶活性和与精子生成相关基因的影响
在补充α-KG对SCCPs诱导的雄性生殖毒性影响的实验结果中，补充α-KG显著增加了其代谢物的水平（图5A），提高了TET酶活性（图5B），减轻了SCCPs诱导的5mC增加和5hmC减少（图5C）。并且α-KG的补充显著降低了精子发生相关基因启动子的甲基化水平（图5D）以及恢复了精子发生相关基因的mRNA和蛋白表达水平（图5E）。α-KG的补充还可以减轻SCCPs诱导的四倍体与二倍体细胞比例的降低（图5F）。精子活力、计数和活动率均有得到改善（图5G-H），SCCPs诱导的睾丸损伤也有所减轻（图5I）。
图5 补充ɑ-KG对SCCPs男性生殖毒性的影响
为了探讨SCCPs损害精子发育的分子机制，作者进一步研究了氧化应激在SCCPs对GC-1细胞毒性中的作用。SCCPs暴露降低了GC-1细胞的活力（图6A），增加了氧化应激标志物的水平（图6B），并降低了TAC相关代谢物和酶活性的水平（图6C-D）。此外SCCPs还激活了TGFβ通路，这可能是氧化应激导致TAC代谢受损的一个介导因素（图6E）。这些结果表明氧化应激和TGFβ通路的激活可能是SCCPs诱导的睾丸损伤的关键机制。
图6 氧化应激对GC-1细胞中SCCPs诱导的TAC代谢受损的影响
最后作者对TGFβ通路在SCCPs诱导的GC-1细胞中TAC代谢受损中发挥作用的机制进行了研究。TGFβ1处理虽然未直接增加氧化应激标志物的水平（图7A-B），但通过激活TGFβ通路，降低了TAC代谢酶的活性，抑制了TAC代谢（图7C-D）。此外，TGFβ1还减弱了NAC对SCCPs诱导的TAC代谢受损的保护作用（图7E），表明TGFβ通路的激活可能是SCCPs诱导的代谢紊乱和生殖毒性的一个重要机制。
图7 TGFβ通路对SCCPs诱导的TAC代谢受损的影响
综上所述，本研究揭示了SCCPs通过抑制α-KG和TET酶活性，损害小鼠精子发生过程的机制。SCCPs降低了睾丸中α-KG含量，导致DNA甲基化水平升高，进而影响精子发育相关基因的表达，降低精子质量。研究结果为探究SCCPs的生殖毒性提供了新的视角，并发现补充α-KG可能有助于减轻SCCPs引起的生殖损伤，对预防和治疗SCCPs的生殖毒性具有重要意义。
文章编号：439
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.4c05895
原文引用：
Ruiyang Meng#, Xingde Du#, Yu Fu, Fufang Wang, Yingfei Yang, Feiyang Guo, Xin Wang, Kangfeng Ge, Jun Yang, Xiao Liang, Hongxiang Guo, Wenjun Wang, Xiaodong Liu*, Huizhen Zhang*. Short Chain Chlorinated Paraffins Impaired Spermatogenesis Process in Mice via Inhibiting α-KG/TET Enzyme Activity. Environ. Sci. Technol., 2024, 58, 17270−17282.（#为共同第一作者）
