供稿：曾黎，武汉大学
校稿：顾淑怡，武汉大学
推送：顾淑怡，武汉大学
今天给大家分享的文章发表在Advanced Science上，标题为Early Diagnosis of Colorectal Cancer Based on Bisulfite-free Site-specific Methylation Identification PCR Strategy: High-Sensitivity, Accuracy, and Primary Medical Accessibility，通讯作者是上海交通大学生物医学工程学院的古宏晨教授、徐宏研究员及仁济医院的钟鸣医师。
结直肠癌（CRC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，由于生活水平的提高、全球人口老龄化和社会人口结构的变化，CRC的发病率和死亡率不断上升。DNA的异常甲基化被认为是肿瘤发生的早期分子事件，且已被证明特定基因的异常甲基化在CRC诊断中具有较高的灵敏度。然而，目前DNA甲基化检测方法大多需要重亚硫酸盐等化学转化过程，此类方法存在转化操作繁琐、耗时长、自动化难度大等问题，从而大大降低了检测效率并增加了对实验技能的要求。因此，有必要开发基于人群的初级CRC筛查新方法。
端点特异性PCR扩增技术（STEM-PCR）是一项基于普通PCR平台的无需重亚硫酸转化，且能实现对特定甲基化位点检测的创新DNA甲基化检测技术（图1）。在本研究中，作者采用创新的STEM-PCR技术，通过病例对照研究，建立了一种无需重亚硫酸盐转化、适合基层医疗机构实践可用于肠癌早筛/早诊的高灵敏度、高特异性肠癌相关DNA甲基化检测新方法（ColoC-mSTEM），并首次探究了特定甲基化位点是否可作为CRC的肿瘤标志物。
图1 STEM-PCR方法检测原理图。
首先，为通过STEM-PCR技术准确识别早期CRC甚至癌前病变，作者用基于机器学习的生物信息学方法，从TCGA和GEO数据库中筛选CRC相关的SFRP2和SDC2基因甲基化位点，探讨特异性甲基化的CpG位点是否可以作为CRC的诊断标记。作者对CRC肿瘤组织样本与正常组织样本进行t检验，选取p值小于0.05的位点。在TCGA数据库中筛选出31个SDC2基因甲基化位点和42个SFRP2基因甲基化位点。然后，采用F-score特征选择算法结合各位点的坐标距离，选取区分能力强、位置相对集中的CpG位点。最终鉴定出7个与CRC相关的CpG位点。其中，单甲基化位点SDC2-4:cg16935295对CRC的分类最有效。在SDC2-4的基础上加上SDC2-2（cg13096260）、SDC2-3（cg24732574）、SFRP2-6（cg25645268）、SFRP2-1（cg10318528）、SFRP2-2（cg05774801）、SFRP2-4（cg03202804个位点）构建Ft7模型（图2）。在Ft7模型的7个甲基化位点中，只有4个可以被DNA内切酶GlaI消化，以这4个消化产物为完整模板设计引物以建立有效的CRCDNA甲基化STEM-PCR检测(ColoC-mSTEM)。并以以下挑选原则：SDC2基因中所选的CpG位点主要位于启动子和5′UTR区域，而SFRP2基因中甲基化位点分布相对较广，包括5′UTR、外显子、3′UTR和非编码区。人工补充了SFRP2-3（chr4：153788844）和SDC2-6（chr8：96494187）来开发ColoC-mSTEM。
图2选定位点以开发ColoC-mSTEM。
在肿瘤或癌前病变发展的早期阶段，肠道脱落细胞中来自粪便DNA的异常甲基化DNA的丰度相当低，而来自未甲基化的基因组DNA和细菌DNA的背景噪声水平极高。因此，当存在大量干扰DNA时，高灵敏度检测分析尤为重要。为了评估ColoC-mSTEM检测的分析性能，作者检测了30 ng基因组DNA的混合物，其甲基化百分比为10%，5%，1%，0.5%，0.1%和0%。如图3所示，在SFRP2和SDC2基因中的9个候选位置成功检测到10%-0.1%的甲基化模板，通过进一步评估10%甲基化模板，结果显示在所有9个候选位置都存在甲基化的胞嘧啶，证实了ColoC-mSTEM的准确性。同时作者也对ColoC-mSTEM的精密度进行了评估，在不同时间下对5种浓度的完全甲基化基因组DNA进行检测。结果表明，除SDC2-5外，其余8个CpG位点在检测中检出率均为100%，无扩增信号。这些结果表明，ColoC-mSTEM具有较好的准确性和精密度，并且足够稳定，可以用于临床样品的检测。
图3 ColoC-mSTEM的灵敏度和准确性。
为了评估ColoC-mSTEM检测的特定CpG位点是否能区分CRC患者和正常人，作者分析了不同CpG单位点组合的敏感性和特异性，并通过甲基化标记物的逻辑回归分析应用了多位点模型。随着甲基化位点数量的增加，CRC的诊断效能也随之提高，其中模型3中SDC2-6、SFRP2-1和SDC2-1的组合诊断效能最好(AUC = 0.975)。在480名参与者的样本中，ColoC-mSTEM显示出高达91.2%的灵敏度和95.7%的特异性，表明ColoC-mSTEM在CRC检测中的有效性。此外，结合SDC2-6和SFRP2-1的检测策略进一步提高了阳性率（图4）。
图4 ColoC-mSTEM诊断模型的有效性。
最后，作者还将ColoC-mSTEM的表现与传统的粪便隐血试验（FOBT）和肿瘤标志物进行了比较，ColoC-mSTEM对非CRC人群的特异性显著高于FOBT，这表明ColoC-mSTEM在早期CRC检测中具有更高的灵敏度和特异性。DNA甲基化检测方法有可能取代或补充FOBT作为基于人群的CRC筛查的初级筛查工具，以降低正常人初级筛查的假阳性率。
综上所述，本研究提出了一种新型的ColoC-mSTEM检测系统，采用无亚硫酸盐的PCR方法，能够特异性地检测CRC相关的甲基化位点。该方法具有灵敏度高、准确度高、操作简便等特点，是一种真正基层可及的CRC早筛早诊的新方法。ColoC-mSTEM不仅对CRC的早期诊断和早期干预治疗有着重要的现实意义，而且还对其他癌种的公共卫生预防具有重要的借鉴意义。
文章编号：438
原文链接：
https://doi.org/10.1002/advs.202401137
原文引用：
Linqing Zhen#, Xinlu Tang#, Zhengguo Xu#, Yizhou Huang, Xiaohua Qian, Haiping Lin, Chao Li, Rong Cui, Hongsheng Fang, Hao Yang, Jiani Qiu, Zhaoqi Fang, Xiaohuan Peng, Yifeng Jin, Jianing Nie, Shiwei Guo, Yuguang Wang, Ming Zhong*, Hongchen Gu*, Hong Xu*. Early Diagnosis of Colorectal Cancer Based on Bisulfite-free Site-specific Methylation Identification PCR Strategy: High-Sensitivity, Accuracy, and Primary Medical Accessibility. Adv. Sci., 2024, 11(33): 2401137.（#为共同第一作者）
