供稿：冯甜，武汉大学
校稿：余思宇，武汉大学
推送：余思宇，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Environmental Science & Technology上，标题为Bisphenol C Induces Cardiac Developmental Defects by Disrupting m6A Homeostasis，通讯作者是浙江大学环境医学系许志宏教授。
在环境和人体样本中均可检测到广泛使用的塑料添加剂双酚A（BPA）。由于BPA通过雌激素途径对生殖和发育产生有害影响，因此在许多国家已被限制或禁用，几种BPA替代品已被广泛应用。然而，人们对这些BPA替代品的生物效应知之甚少，迫切需要评估这些BPA替代品在早期发育中的作用。作者筛选了常见BPA替代品的早期发育毒性，并论证了双酚C（BPC）的心脏毒性。
在斑马鱼早期发育阶段，从受精后4到8小时（hpf）进行急性BPC暴露。2、4和8 μM BPC 暴露后，在72 hpf下测得的鱼体中的BPC水平分别为41、85和150 nM，和婴儿和学步儿童的尿液中检测到的BPC水平（6-186 nM）相当（图1A）。应用转基因斑马鱼胚胎Tg（lcr:eGFP）（lcr，一种红系标记基因）和Tg（myl7:eGFP）（myl7，一种心肌细胞标记基因），作者发现BPC暴露导致心包区域血液充血（图1B）。经BPC处理后，侧位视图中的心房-心室角、静脉窦和动脉球距离（SV-BA距离）明显增加，心脏形态异常（橙色虚线:心室轮廓的腹侧视图），表明BPC破坏了心脏环和基本结构（图1C）。心率和活力的下调进一步表明BPC介导的心脏功能损害（图1D，E）。心力衰竭标记基因（nppa和nppb）的上调在分子水平上证实了BPC诱导的心脏发育缺陷（图1F）。此外，作者将斑马鱼慢性暴露（从4 hpf到3个月）于2到200 nM （2、10、20、50、100和200 nM）BPC。从20 nM开始观察到心脏缺陷，浓度越高导致的缺陷越严重（图1G）。这些结果表明，人体内接触BPC水平对心脏发育具有毒性，并导致心脏功能和形态缺陷。
图1 BPC在斑马鱼中显示心脏毒性
接下来作者研究了BPC引起心脏毒性的机制。从BPC暴露的Tg（myl7:eGFP）（myl7，一种心肌细胞标记基因）斑马鱼中分离心脏，并研究m6A是否在BPC介导的心脏缺陷中发挥作用。m6A斑点印迹和免疫荧光（IF）都显示BPC暴露的斑马鱼心脏中m6A水平降低（图2A，B）。通过mettl3 mRNA微注射过量表达Mettl3回补了m6A水平（图2C）和BPC诱导的心脏缺陷，包括心包充血、成环角度和SV-BA距离、心脏形态学、心脏活动、心率和心力衰竭标志物（图2D，E）。上述结果表明BPC很可能通过破坏Mettl3-m6A调节轴而诱发心脏缺陷（图2F）。
图2 BPC暴露影响斑马鱼心脏RNA m6A稳态
为了确定BPC诱导心脏表型的下游机制，作者进行了RNA-seq和Mettl3-RIP-seq以发现BPC和Mettl3共调控的基因。最终得到5个候选基因，只有acox1（过氧化物酶体中分解脂肪酸的主要氧化酶）在心血管系统中表达（图3A）。Mettl3敲除和BPC暴露均导致acox1 mRNA中m6A水平显著降低，随后acox1 mRNA及其蛋白水平下调（图3B），这表明BPC通过影响Mettl3介导的m6A甲基化下调acox1 mRNA。Acox1的过度表达挽救了心脏缺陷，如心包充血、心脏环指标和形态学（图3C，D），这些结果表明BPC-Mettl3-m6A修饰的acox1轴在BPC诱导的心脏缺陷中的重要性（图3E）。
图3 BPC通过下调Acox1诱导心脏发育缺陷
随后作者研究了m6A通过BPC暴露影响Acox1的机制。由于m6A修饰的mRNA的命运是由m6A结合蛋白决定的，作者筛选了m6A主要的结合蛋白在BPC暴露下的拯救能力。如图4A所示，在主要的m6A受体中，只有Igf2bp2b可以挽救心包充血表型，这表明Igf2bp2b是BPC-Mettl3-m6A修饰的acox1轴中的关键成分。Igf2bp2b是一种m6A结合蛋白，可识别并稳定m6A修饰的mRNA。作者观察到BPC暴露导致acox1上m6A水平的降低，从而降低Igf2bp2b与acox1的结合水平，这导致acox1 mRNA的下调和Acox1蛋白水平的降低（图4B）。只有野生型而不是m6A结合缺陷型突变体Igf2bp2b能有效地结合acox1 mRNA并挽救BPC诱导的心包充血（图4C）。这些数据不仅证明了Igf2bp2b以m6A依赖的方式调节acox1 mRNA，还证实了Igf2bp2b是BPC诱导的心脏缺陷的关键调节因子（图4D）。
图4 Igf2bp2b是负责BPC介导缺陷的关键m6A结合蛋白
在验证了Igf2bp2b在BPC诱导的心脏缺陷中的关键作用后，作者发现Igf2bp2b表现出比Acox1更强的拯救作用（图5A），这表明除了Acox1之外，BPC暴露后可能还有其他下游途径受Igf2bp2b调节。然后作者进行Igf2bp2b RIP-seq分析，并将结果与Mettl3靶基因和受BPC影响的基因重叠（图5B，左图）。心肌肌钙蛋白的一种成分肌钙蛋白T 2d（Tnnt2d）在GO富集的肌肉收缩途径中显示出最显著的下调（图5B，右图）。过度表达Tnnt2d明显挽救了BPC介导的心脏缺陷（图5C），证实了Tnnt2d在BPC诱导的缺陷中的关键作用。同时共注射acox1和tnnt2d mRNA比分别注射acox1或tnnt2d mRNA显示出更强的拯救效应（图5D，E），这种叠加效应进一步支持acox1和tnnt2d在不同的轴上。这些结果证明尽管共享相同的上游“BPC-Metll3-m6A-Igf2bp2b”轴，tnnt2d和acox1并不相互调节（图5F）。总的来说，BPC影响m6A水平从而影响两种不同的心脏功能调节途径中的关键基因，这两种途径都导致了BPC介导的心脏缺陷。
图5 BPC-Igf2bp2b-Tnnt2d参与了BPC诱导的心脏缺陷
综上所述，该研究不仅提供了证据表明人体内BPC的暴露水平可能导致心脏发育缺陷，而且还通过破坏Mettl3-m6A-Igf2bp2b-Acox1/Tnnt2d途径证明了BPC介导的缺陷的潜在机制，这提供了与BPC暴露相关的潜在分子标记。
文章编号：429
原文链接：
https://doi.org/10.1021/acs.est.4c04373
原文引用：
Kunhui Su#, Jinfeng Liu#, Jiafeng Chen#, Hengyu Wu, Wenbin Tang, Siqi Sun, Jiebo Lin, Guankai Zhan,and Chih-Hung Hsu*. Bisphenol C induces cardiac developmental defects by disrupting m6A homeostasis. Environ. Sci. Technol., 2024. DOI: 10.1021/acs.est.4c04373.（#为共同第一作者）
