供稿：赵晨茜，武汉大学
校稿：曾黎，武汉大学
推送：曾黎，武汉大学
今天给大家分享的文献发表在Molecular cell上，标题为Nuclear PKM2 binds pre-mRNA at folded G-quadruplexes and reveals their gene regulatory role。通讯作者是来美国国立卫生研究院的Markus Hafner教授。
各种癌症中广泛观察到代谢酶PKM2的核定位，且肿瘤中PKM2的非代谢活性可促进有氧糖酵解、细胞增殖、迁移等。此前体外研究发现，核PKM2作为一种非典型RNA结合蛋白 （RBP）可以直接结合RNA，其中与RNA G-四链体 (rG4）结合最稳定。但尚缺少PKM2与rG4体内结合的证据。
首先，本研究通过RNA Bind -n-seq（RBNS）方法来更严谨地探索PKM2与rG4序列结合的决定因素（图1）。结果显示，标准的rG4标序列得到了显着富集（图1）。且只有当 K+存在的情况下PKM2才能与折叠的rG4结构相互作用，而Li+存在的条件下则不能（图1）。然后作者使用电泳迁移率实验（EMSA）来验证PKM2是否与折叠rG4结构的相互作用。结果显示PKM2与启动子区域中含有G4的MYC结合力与G4解旋酶DHX36和MYC的结合力基本一致（图1）。上述结果表明，PKM2可与形成G结构的RNA序列结合。
图1 在体外PKM2与折叠的rG4s结合
接着，作者通过PAR-CLIP实验全面绘制了PKM2与RNA相互作用图谱（图2）。结果表明，在293T细胞和人乳腺癌细胞中，核PKM2的结合位点主要集中在内含子的pre-mRNA区域（图2）。然后作者通过MEME基序分析发现，核PKM2在结合RNA时更倾向于识别和结合G-rich序列（图2）。上述实验结果表明，核PKM2可结合pre-mRNA中的G-rich序列。
图2 核PKM2可结合pre-mRNA中的G4
作者将核PKM2稳定敲低的细胞进行转录组分析后发现，当核PKM2缺失后，在外显子和剪切位点附近以及远离剪切位点的内含子区域中包含G4的mRNA表达水平显著降低（图3）。表明，核PKM2的减少会降低含有G4的pre-mRNA表达丰度。
图3 核PKM2的减少会降低其靶向pre-mRNA的丰度
作者进一步通过RNA聚合酶 II (RNA Pol II) 亚基未磷酸化C末端结构域（CTD）的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）来探索这种相互作用是否影响转录动力学（图4）。研究发现 PKM2在293T细胞中稳定过表达（FH-PKM2-NLS）后，RNA Pol II在含有G4的mRNA的转录起始位点的占比率降低（图4）。随后，作者对丝氨酸 2 （S2P） 磷酸化的CTD通过ChIP-seq实验（标记延伸的 RNA Pol II）揭示了在FH-PKM2-NLS中延伸的RNA Pol II的增加（图4），因此可能增加含有 G4的mRNA的转录输出。RNNA-seq实验结果显示，随着PKM2在细胞核中的增加，含有rG4结构的mRNA的转录水平显著增加（图4）。但内含子和外显子总体比例并没有发生变化（图4）。上述实验结果表明，PKM2对mRNA的调控主要发生在转录层面而非剪接层面。
图4 PKM2对rG4的结合促进了转录的延伸
为了探索含有G4的pre-mRNA是否与上皮-间充质转化细胞（EMT）有关，作者重新分析了乳腺癌EMT模型的基因表达数据。结果显示，当细胞从较少致病状态（E）转变为与肿瘤侵袭和转移密切相关的上皮/间质混合状态（E/M）时，核PKM2的高表达也伴随着mRNA的表达丰度上调（图5）。当细胞处于E/M状态时，与E状态的细胞相比，E/M细胞状态中含有G4的pre-mRNA的表达丰度显著增加（图5）。而当细胞从E/M细胞状态转变为致瘤性较小的xM状态时，含有G4的pre-mRNA的表达丰度再次下降（图5）。上述结果表明，PKM2-rG4相互作用可允许rG4标记的关键基因组来促进细胞迁移表型，这为含有G4的pre-mRNA表达与癌症之间的联系提供了证据。
图5 含有G4的pre-mRNA与侵袭性癌症表型相关
综上所述，本研究为 rG4结构在pre-mRNA的中形成以促进其表达提供了最新的实验室数据，并鉴定出可以与rG4结构相互作用以调节基因表达的RBP（PKM2）。且PKM2-rG4可作为一个有吸引力的靶点来控制肿瘤的发生发展。
文章编号：424
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276524006233
原文引用：
Dimitrios G. Anastasakis, Maria Apostolidi, Khalid A. Garman, Ahsan H. Polash, Mubarak I. Umar, Qingcai Meng, Jeremy Scutenaire, Jordan E. Jarvis, Xiantao Wang, Astrid D. Haase, Isaac Brownell, Jesse Rinehart and Markus Hafner*. Nuclear PKM2 binds pre-mRNA at folded G-quadruplexes and reveals their gene regulatory role. Mol. Cell., 2024, 6:S1097-2765(24)00623-3.
