1.研究背景
孤独症谱系障碍（autism spectrum disorderASD）是一种复杂的神经系统发育性疾病，近些年，其发病率和患病率均显著增加，但其病因和发病机制仍尚未明确。
口腔菌群位于消化道的入口，具有不同于肠道的微生物种类。尽管在生物量和复杂性方面有限，但研究发现，许多疾病患病的口腔菌群发生改变，包括孤独症、阿尔茨海默病、发育迟缓和双相情感障碍等，表明存在潜在的口腔菌群-脑相互作用机制。
然而，还需更多证据来探究口腔菌群与孤独症致病机制的关系，以及其动力学是否与肠道菌群相关。
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在人类微生物区系中，噬菌体通过促进营养物质周转和水平基因转移，成为微生物群多样性的重要驱动力。宏基因组测序已经揭示了人类肠道菌群中广泛、多样化和动态的噬菌体种群。
尽管个体之间不同，但肠道噬菌体群落的动态与不同的疾病状态相关。除了直接调节细菌的繁殖外，噬菌体也可以与黏膜上皮细胞和免疫细胞相互作用，影响炎症状态和微生物定植。
尽管这些结果显示了噬菌体对ASD等神经系统疾病的发病机制的潜在影响，但对其的深入评估仍然较少。因此研究噬菌体参与孤独症致病机制具有重要意义。
2.研究方法
研究者招募了26名ASD和26名健康对照儿童，分别收集其口腔牙菌斑和粪便样本用于宏基因组测序。数据质控后，利用VIBRANT从每个样本组装的非冗余宏基因组序列中寻找噬菌体和原噬菌体序列，然后使用vConTACT2对鉴定出的噬菌体进行病毒分类注释，只有在动态分析中具有中质量或高质量的病毒序列，或在vConTACT2结果中与已知病毒聚集的病毒序列被保留，使用CheckV进一步评估噬菌体基因组的质量和完整性。进而用差异分析和主成分分析探究口腔和肠道噬菌体的个体间多样性和群落间的相关性，并对口腔链球菌及其噬菌体、毒力因子与ASD致病机制做关联分析。
3.研究结果
(1) 受试者口腔和肠道噬菌体群落
本研究共纳入52名受试者，其中，ASD儿童26名，健康对照儿童26名，男性儿童和女性儿童的比例均为23：3。
牙菌斑是指粘附在牙齿表面或口腔其他软组织上的微生物群，由大量细菌、细胞间物质、少量白细胞、脱落上皮细胞和食物残屑等组成。在经过标准检查和卫生清洁后，牙菌斑被用于检测口腔菌群。
在蛀牙数、牙石指数和口腔卫生方面，ASD儿童和健康儿童无显著差异。
研究者在总共~4200万和~350万大于1kb的contigs中，共获得40,852个潜在的噬菌体原始序列。利用vConTACT2与已知的病毒contigs做对比，在口腔和粪便样本中共获得523和627个contigs。
利用CheckV重新评估了接近完整噬菌体（>90%）的噬菌体基因组长度，结果发现，来自口腔和粪便样本的92个（18%）和142个（23%）噬菌体基因组包含细菌基因。去除细菌污染的基因组区域后，得到纯化的噬菌体基因组，其中，口腔噬菌体的基因组长度（42.7 kb）较肠道噬菌体基因组的长度（55.6 kb）更短。
利用vConTACT2对噬菌体基因组进行注释，结果在口腔和粪便样本中分别鉴定出35%和27%的噬菌体基因组，其中，口腔样本中包含更多的肌病毒科和足病毒科的噬菌体菌株，粪便样本中包含更多的微病毒科噬菌体。
(2) 口腔和肠道噬菌体的个体间多样性和群落间的相关性
研究者通过比较所有口腔样本中每个噬菌体的存在情况，对于给定的噬菌体基因组，将样本中所有相关reads聚类，估计样本中其基因组长度的reads的覆盖率，进一步探究口腔噬菌体群落的多样性。结果发现，设定的阈值越低，在多个样本中出现的可能性越高，且阈值一致时，口腔噬菌体间的个体多样性更大。
为探究噬菌体是否存在广泛的口腔-肠道转移，研究者首先确定了口腔和肠道共享的噬菌体。结果发现，在总共1150个噬菌体中，有11个被两个噬菌体群落共享，且大部分与大肠杆菌相关；其中，3个基因组长度>3kb的噬菌体和1个5kb的噬菌体分别组装自同一个人的口腔和粪便样本，表明噬菌体可能存在口腔-肠道转移。
主成分分析发现，口腔和粪便样本结果显著分离，说明不同环境（口腔和肠道）间噬菌体群落存在较大差异；
且ASD和健康对照样本间的口腔噬菌体群落存在显著差异，这说明ASD口腔噬菌体偏离正常的范围更大，并可能与ASD的致病机制存在独立关联。
Alpha多样性分析发现，ASD儿童口腔噬菌体α多样性显著低于健康对照，而在肠道中，ASD儿童噬菌体α多样性略高于健康对照儿童。
整个微生物群中噬菌体总丰度分析发现，在口腔中，ASD儿童总噬菌体丰度显著低于健康对照儿童，而在肠道中，并无显著差异，说明ASD儿童口腔噬菌体多样性和丰度均显著下降。
(3) ASD儿童口腔链球菌噬菌体富集
研究者利用类配对法探究ASD和健康对照的差异噬菌体，结果发现，在口腔样本中，共有8个高丰度（在>90%样本中）的差异噬菌体，其中，链球菌噬菌体的显著性和倍数变化最高；
在粪便样本中，共鉴定出5个高丰度（在>90%样本中）的差异噬菌体，而链球菌科相关噬菌体在两组受试者之间没有差异。
(4) ASD儿童口腔链球菌毒力增加
比较ASD和健康对照儿童口腔菌群的毒力因子发现，口腔菌群的毒力因子大部分由链球菌和奈瑟菌携带，与健康对照（65%）相比，ASD口腔链球菌（76%）的毒力因子更高，且ASD口腔内链球菌富集程度更高。
相比之下，肠道噬菌体群落的情况与口腔内的变化无关，肠道中链球菌噬菌体、链球菌毒力因子和链球菌的丰度在两组之间没有差异。
(5) 链球菌噬菌体与ASD临床表现的相关性
为了进一步探究口腔链球菌及其噬菌体、毒力因子与ASD发病机制之间的关系，研究者将其与ADOS评分做相关性分析。ADOS评分由四个部分的得分组成，分别为语言与交流（LC）、相互社会互动（RSI）、刻板行为和限制兴趣（SBRI）以及游戏（play），得分越高，临床表现越严重。
相关性分析发现，链球菌噬菌体与ADOS总分以及语言与交流（LC）得分呈显著正相关关系；链球菌毒力因子丰度和ADOS总分以及语言与交流（LC）得分，以及链球菌丰度和ADOS总分均呈现显著的正相关关系。
这些强相关性支持口腔链球菌及其噬菌体和毒力因子在ASD发病机制中的潜在贡献。
4.研究结论
(1)口腔和肠道中噬菌体分布广，种类多，存在口腔-肠道转移，但二者噬菌体组成差异较大，该情况在ASD组中更加显著；
(2)ASD组口腔噬菌体丰度和多样性显著降低，但链球菌噬菌体富集，且占主导作用；
(3)链球菌噬菌体增加伴随口腔链球菌毒力因子和链球菌富集，且与ASD严重程度呈正相关；
链球菌噬菌体与ASD致病机制，口腔特异性、以及独立于肠道中噬菌体的口-脑相互作用机制有关。
此次研究发现，为孤独症致病机制研究提供了新的线索，并为孤独症治疗提供了新思路！
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