一、背景介绍
催产素（Oxytocin）是一种神经肽，主要在大脑的下丘脑中合成，其在外周生殖器官和中枢神经系统中都具有重要的功能。催产素受体（Oxtr）是一种G蛋白偶联受体，可以启动细胞内信号传导，表达于下丘脑、杏仁核、海马和前额叶皮质等在社会识别和记忆、应激和情绪行为中非常重要的区域。
有研究表明，孤独症（Autism Spectrum Disorders，ASD）儿童通常具有较低水平的催产素，缺乏催产素受体的小鼠也会表现出社会行为受损的症状，这说明孤独症的核心症状可能与催产素环路或催产素受体的信号传导被破坏有关。此外，在一些ASD小鼠模型中，催产素治疗已被证明可以逆转社交缺陷。
有研究发现，抗生素耗竭肠道微生物能够改变催产素和受体的表达，这表明肠道微生物与催产素系统存在关联。肠道微生物可以通过肠-脑轴调节中枢神经系统。一些益生菌能够通过调节肠-脑轴的稳态提供健康益处，从而改善宿主的身心健康。先前的研究显示，植物乳杆菌 PS128能够减轻孤独症患者的部分行为症状。
二、研究方法
本项研究采用产前暴露于丙戊酸（valproic acid，VPA）诱导的ASD小鼠模型开展实验。在C57BL/6J野生型（WT）母鼠、Thy1-GFP转基因母鼠以及Oxtr敲除（Oxtr-KO）母鼠怀孕的第12.5天单次腹腔注射600mg/kg VPA，以诱导其后代表现出孤独症样行为。对照组则是注射生理盐水。
VPA子代小鼠及Oxtr-KO VPA子代小鼠在1月龄时断奶，提供纯净水（VPA H2O组、Oxtr-KO VPA H2O组）或与PS128混合的水（VPA PS128组、Oxtr-KO VPA PS128组）作为唯一的饮用水源，持续4周后开展行为学测试。孕期注射生理盐水的WT母鼠的后代被提供纯净水（WT H2O组）或与PS128混合的水（WT PS128组）作为唯一的饮用水源，以进行对照比较。行为学测试后，取6组小鼠的粪便对肠道微生物组的组成和肠道代谢物水平进行了分析，并与行为学测试结果相联系。
Thy1-GFP子代小鼠在1月龄时断奶，提供纯净水或与PS128混合的水作为唯一的饮用水源，持续4周后收集大脑样本，并对样本进行形态学分析和生物化学分析。
三、研究结果
1、PS128减少了VPA小鼠的孤独症相关行为
针对VPA子代小鼠的行为学测试显示，相比于WT小鼠，VPA小鼠的社交能力明显受损，对陌生小鼠和新物体的探索行为减少，社会行为存在缺陷，同时出现自我理毛行为增多、焦虑指数增加、认知行为异常等症状。
而补充了PS128的VPA小鼠，其社交能力显著恢复到和WT类似的水平，对新事物的偏好完全恢复，社会行为缺陷被显著逆转，焦虑、认知行为异常等症状也都得到缓解。但是，其自我理毛的刻板行为没有明显的改善。
综上所述，产前暴露于VPA的小鼠在社会交往、焦虑和动物认知方面表现出ASD样的行为异常，而补充PS128能够显著改善VPA小鼠的行为学异常。
2、PS128恢复了VPA小鼠的神经元形态缺陷和神经元连接
孤独症患者的行为缺陷通常被认为是由树突结构和树突棘密度异常导致的神经元的连接和环路功能被破坏造成的。
1）神经元形态的改变与恢复
对Thy1 - GFP小鼠大脑样本的形态学研究显示，在海马CA1和CA2区以及前额叶皮层中，VPA小鼠的神经元树突分支减少，树突总长度和分支点数量显著减少；而补充PS128对于VPA小鼠的树突形态的破坏有所恢复。这些PS128介导的改善在锥体神经元的基树突和顶树突中都很明显。
2）神经元连接的改变与恢复
树突棘密度通常被用作神经元连通性的指标。形态学研究结果显示，在VPA小鼠的海马CA1、CA2和前额叶皮层区域的基底树突和顶树突中，树突棘密度总体减少了约25%；而补充PS128的VPA小鼠所有检测的树突区域和脑区的树突棘密度都得到了有效的恢复。
此外，树突棘可以根据成熟程度从形态学上分为丝足型、粗短型、细长型和蘑菇型四个类型。在所有实验组中，海马体和前额叶皮层的锥体神经元的树突棘类型的分布相同，但棘突类型存在差异：2月龄WT小鼠的锥体神经元的主要棘突类型为长细形和蘑菇形；而在VPA小鼠中这两种更成熟的棘突类型的密度都显著降低。
以上结果表明，VPA小鼠的海马体和前额叶皮层的树突分支和树突棘密度受到明显损伤，而补充PS128能够恢复这种损伤。PS128缓解VPA诱导的行为学异常的能力似乎与这种恢复树突形态和促进神经元连接的能力有关。
3、PS128恢复VPA小鼠中失调的信号传导和谷氨酸受体表达
为了研究PS128恢复VPA小鼠神经元形态的分子机制，对海马匀浆中存在的关键蛋白进行了生化分析。由于VPA小鼠的树突棘密度显著降低，还对这些蛋白在突触后密度（postsynaptic density，PSD）组分中的分布进行了分析。
生化分析表明，在VPA小鼠的匀浆和PSD组分中，磷酸化或活化的Erk1/2和CaMKⅡα的水平均降低；而PS128的补充显著恢复了这些激酶的活性。在VPA小鼠的PSD组分中观察到PKA催化亚基（PKA-C）的减少，但在匀浆中的水平与对照相似。
对海马体匀浆和PSD组分中的谷氨酸受体水平进行检查，发现NMDA受体的必须亚基GluN1的表达在VPA小鼠的匀浆和PSD组分中均降低，AMPA 受体GluA2亚基的表达在PSD组分中降低。PS128的补充可以使VPA小鼠恢复到WT小鼠相当的状态。
基于这些生化结果，可以推测突触处Erk1/2、CaMKIIα和PKA激酶活性的降低可能会对信号级联、基因转录和谷氨酸受体信号的中断产生影响。此外，GluN1和GluA2表达的改变可能会损害兴奋性突触传递和可塑性，进而影响动物行为。
4、PS128恢复VPA小鼠室旁核中催产素水平，并通过催产素受体信号恢复VPA小鼠的行为缺陷
1）催产素水平的改变与恢复
Erk、CaMKII和PKA作为催产素受体的下游靶点，活性受到催产素的调节。因此，PS128可能通过调节催产素的表达来恢复催产素信号。
对含有下丘脑室旁核（PVN）的催产素荧光信号的定量显示，VPA小鼠的PVN内催产素荧光强度明显减弱，催产素阳性细胞数量显著减少；这些PVN催产素水平和催产素阳性细胞的降低可以通过PS128治疗得到恢复。
这些发现表明，产前暴露于VPA降低了PVN中的催产素水平，而补充PS128可以使催产素表达恢复到WT水平。已知起源于肠道的迷走神经投射并支配PVN，因此，PS128可能通过依赖于迷走神经的微生物群-脑轴提高PVN中催产素的表达。
2）PS128通过催产素受体信号通路影响与海马体有关的空间记忆功能
针对Oxtr-KO VPA子代小鼠的行为学测试显示，Oxtr-KO VPA小鼠展现出同野生型VPA小鼠相似的孤独症样行为，如社交能力降低，社交偏好减弱，焦虑水平增高，空间记忆能力减弱等。但是，PS128没能改善Oxtr-KO小鼠的症状。这表明催产素受体对于PS128介导的社会行为的恢复和焦虑症状的减轻是必需的，PS128需要通过催产素受体信号通路影响海马体依赖的空间记忆。
值得注意的是，在PS128处理的WT小鼠中没有观察到社交行为、焦虑和空间记忆的任何增强，这表明PS128不影响WT小鼠的基本行为特征。
综上所述，PS128可以恢复VPA小鼠的社交和记忆缺陷，但不能恢复Oxtr - KO VPA小鼠的社交和记忆缺陷。催产素受体信号在通过PS128介导的肠-脑轴减少ASD相关行为中，起到了的关键作用。
5、PS128改变肠道菌群组成，增加双歧杆菌丰度
1）肠道微生物群的多样性和丰度
小鼠肠道微生物群的Alpha多样性分析发现，不同组小鼠体内的细菌物种数量相似，但物种丰富度和均匀度存在差异，肠道微生物群落结构有偏差，细菌物种不平衡。而Beta多样性分析发现，小鼠肠道微生物不同的多样性模式取决于小鼠被提供的饮用水种类。
对各组小鼠肠道菌群差异丰度的分析显示，PS128处理的VPA和Oxtr - KO VPA小鼠的系统发育分布具有明显的分支模式，小鼠肠道菌群的优势菌属存在较大差异。
2）双歧杆菌的丰度与PS128存在关联
小鼠粪便样品中不同微生物分类群的相对丰度在不同组之间表现出不同的模式，其中仅有双歧杆菌在PS128添加组和水处理组之间表现出显著差异，PS128可能促进了双歧杆菌在肠道中的定植。
植物乳杆菌（L.plantarum）在正常饮水的各组中均未被检测到，表明PS128是小鼠肠道菌群中的外源性物种。进一步分析L . plantarum与其他物种的相对丰度相关性发现，只有双歧杆菌属（Bifidobacterium）的丰度与植物乳杆菌呈正相关。
3）双歧杆菌的丰度对动物行为的影响
VPA H2O组和VPA PS128组粪便样品中，双歧杆菌的相对丰度与社会偏好指数呈显著正相关，与焦虑指数呈现负相关，这说明随着双歧杆菌丰度的增加，小鼠的社会行为有所改善，焦虑行为也随之减少。此外，尽管没有达到统计学意义，双歧杆菌丰度也显示出与嗅闻时间及记忆成绩呈正相关的趋势。
4）肠道代谢物的改变
对微生物群的功能分析发现，与氨基酸和次级代谢产物生物合成相关的通路在所有接受PS128补充的组中显著上调。
本研究使用质谱定量分析小鼠粪便样品中的短链脂肪酸。结果显示，大多数短链脂肪酸的浓度在所有组之间没有显著差异。尽管丁酸的含量在Oxtr-KO VPA PS128组小鼠中显著升高，但PS128处理的Oxtr-KO VPA小鼠没有观察到行为学的改善；这表明增加的丁酸对小鼠的行为没有可检测的影响。这些发现表明，在VPA诱导的孤独症小鼠模型中，短链脂肪酸并不负责PS128相关的行为表现的恢复。
四、小结
1、补充PS128不仅在社会交往方面改善了小鼠与孤独症相关的核心行为异常，而且在解决焦虑和认知缺陷等孤独症共患病方面表现出了显著的有效性。
2、补充PS128可以有效地恢复VPA小鼠的树突形态并促进神经元连接，从而缓解VPA诱导的行为学异常。该过程的分子机制与PS128恢复Erk、CaMKII和PKA等激酶活性的能力有关。
3、补充PS128能够恢复催产素的表达，恢复树突损伤，从而改善VPA诱导的孤独症小鼠模型的行为缺陷。
4、植物乳杆菌PS128诱导了肠道微生物组成的变化，并促进了有益菌属双歧杆菌属的丰度。
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