背景介绍
DNA甲基化常见于胞嘧啶和CpG位点，属于一种重要的表观遗传修饰方式，可以在不改变DNA序列的基础上可逆调节基因表达。
有研究表明，孤独症患者CpG位点的DNA甲基化模式与健康对照组相比有差异，在胎盘组织中也发现了这种差异，所以提示在胚胎神经发育过程中，孤独症患者的表观遗传修饰可能参与影响神经系统发育。
神经网络处理信息的关键是维持兴奋（E）和抑制（I）平衡，兴奋-抑制失衡也是引起孤独症的其中一种病理机制。γ-氨基丁酸(GABA)是抑制性神经递质，在维持脑内E/I平衡中起着关键作用。
GAD1是调控GABA水平的关键基因，它能编码催化GABA合成的谷氨酸脱羧酶异构体，所以GAD1是评估E/I平衡的关键生物标志物。
为了研究孤独症患者在胚胎发育过程中GAD1甲基化模式的变异情况，研究者用孤独症患者与健康个体的诱导多能干细胞（iPSCs）培育生成脑类器官（cerebral organoids），用脑类器官对GAD1基因的已知调控靶区进行了靶向DNA甲基化分析。
一 、 脑类器官的培育阶段
研究者使用从全脑类器官中提取的 DNA 进行亚硫酸氢盐测序，以分析 GAD1 基因调控区的甲基化状态。
（一）人类来源的脑类器官培育主要分为两个阶段
一、利用受试者皮肤活检组织生成诱导多能干细胞。
二 、利用诱导多能干细胞产生拟胚体，最后发育成脑类器官。
（二）研究者选取的GAD1 基因靶区
研究者选择了靠近GAD1启动子的一个CpG岛，因为已有研究证明这片区域与GABA表达具有功能相关性，并且包含一个含有CpG的CTCF结合位点，其中CTCF结合位点会调节GAD1的表达。
图1：脑类器官培育阶段与人类GAD1基因靶区
图1A：人类来源脑类器官的培育过程。
图1B：拟胚体培育第1天的示例图像。
图1C：脑类器官培育第1天的示例图像。
图1D：脑类器官培育第39天的示例图像，研究者收集此时脑类器官的基因组DNA用于GAD1甲基化分析。
图1E：图E是研究者进行甲基化分析的GAD1靶区，此研究分析了含有CTCF结合位点的CpG岛，已有研究证明该岛与人细胞中GAD1基因的转录相关。
图注：其中39个潜在的CpG甲基化位点显示为蓝色。下划线区域是CTCF结合序列。
二 、孤独症受试者的脑类器官中GAD1 的DNA甲基化模式更加多样化
本研究中使用的脑类器官来自5名健康对照组和4名孤独症受试者。研究者通过亚硫酸盐测序，分析了转录起始位点下游约3400bp处GAD1基因调控区域的甲基化状态。
研究结果：
对照组：研究者在对照组中观察到明显的甲基化谱。
其中大多数(94.3%)随机挑选的克隆在整个扩增子中具有高甲基化水平。在5个对照类器官中仅检测到1个含有甲基化<50%的扩增子克隆（图A）。
孤独症组：在孤独症组中，研究者观察到，尽管绝大多数(90.3%)克隆也表现出高水平的甲基化，但是4个孤独症组脑类器官中检测到3个含有甲基化<50%的扩增子克隆的(图B)。
图2：脑类器官中GAD1靶区的单个CpG位点的甲基化模式。
图2A：来源于5名健康受试者的70个克隆。
图2B：来源于4名自闭症受试患者的62个克隆。
图注：
每行表示随机选择的受试者的GAD1扩增子克隆；
下方的横向数字表示扩增子内的单个的CpG位点；
黑点表示甲基化的胞嘧啶；
白点表示未甲基化的胞嘧啶；
×表示胞嘧啶—腺嘌呤突变；
图2下方的白色面板显示甲基化率<50%的克隆。
此外，研究者发现孤独症组中扩增子的DNA甲基化谱多样性有所增加，为了进一步分析两组的甲基化状态，研究者对甲基化>50%的显性群体的不同甲基化模式进行了进一步分析。
由于甲基化差异不仅存在于在个体之间，还存在于不同组织器官之间，因此研究者亚克隆目标扩增子，以单细胞分辨率方式来鉴定GAD1的 DNA甲基化模式，观察每组的共同点。
一、结果发现（如图3B）
孤独症组：有11种克隆表现出独特的甲基化模式（pattern7-17）。
对照组：只有1种克隆具有独特的甲基化模式（pattern5）。
这表明孤独症组中很大比例的细胞都具有独特的甲基化模式（与对照组规律有差异）。
二、对研究结果的分析
孤独症组内的甲基化水平高度变异，CpG相关变异度增加，二者提示了在发育过程中调节DNA甲基化的成分可能遭到了破坏。
既往有研究表明，成年孤独症患者大脑中表观遗传学通路的关键成分双加氧酶（TET）的mRNA的表达显著增加；此外，DNA甲基转移酶1（DNMT1）与靶区上游区域的GAD1的结合频率增加。
DNMT可以维持DNA甲基化，TET家族酶可以介导活性去甲基化过程。
因此，研究者推测在早期发育阶段中是这两种表观遗传的关键成分破坏，使得孤独症患者的甲基化模式多样性增加。
图3：从脑类器官的GAD1靶区中发现的DNA甲基化模式。
图3A：孤独症组与对照组DNA甲基化＞50%的扩增子的不同甲基化模式。
图3B：两组中每种DNA甲基化模式的克隆数量。
三 、GAD1靶区CpG位点的差异甲基化
为了进一步比较DNA甲基化特征的多样性，研究者分析了扩增子甲基化率>50%的克隆的每个CpG位点的甲基化变异度。
一、研究结果
（1）与对照组相比，孤独症组共有6个CpG位点甲基化差异显著（图4A），并且孤独症组CpG位点总体变异度增加（图4B）。
（2）在孤独症组中，6个差异甲基化的CpG位点中，5个都是低甲基化。
（3）差异甲基化的6个CpG位点中，有3个位都位于CTCF结合位点。
二、对研究结果的分析
在GAD1靶区中存在CTCF的结合序列，CTCF是一种转录因子蛋白，能够与增强子、启动子相互作用来调节转录。当CTCF的结合序列的DNA发生甲基化时，可以通过阻止CTCF介导的多梳蛋白抑制复合物2募集过程，从而激活GAD1的表达，导致GAD1转录增加，mRNA表达增加。
值得注意的是，研究结果发现孤独症患者中发现的6个差异甲基化CpG位点中有3个位于CTCF结合位点，其余差异化CpG位点离CTCF结合位点也很近（上下100个碱基对以内)，提示孤独症患者的CTCF结合位点是很容易发生差异甲基化的。
虽然位于CTCF结合位点中的3个差异化的CpG位点是连续的（如图4A上图，位点28、29、30），但是位点28高甲基化，而位点29和30却是低甲基化的。由于相邻的CpG位点通常应该具有相同的甲基化状态，所以这是一个异常的现象。
这提示了尽管每个CpG位点的甲基化状态对CTCF结合序列产生的影响还不明确，但是这三个位点的差异甲基化表明孤独症受试者类器官中转录因子CTCF结合目标序列的概率会发生变化。
除此之外，研究结果中显示CTCF结合序列内甲基化的总体趋势减少。因为如上文所述，正常情况下CTCF的结合序列甲基化时，DNA甲基化可以通过阻止CTCF介导的多梳蛋白抑制复合物2募集过程，激活GAD1的表达，导致GAD1转录增加，mRNA表达增加。所以，CTCF甲基化降低能解释孤独症患者中会观察到的GAD1和GAD67的表达下降现象。
图4A上图：GAD1靶区中CpG位点的差异甲基化。
图4A下图：将GAD1扩增子中的CpG位点定位于人类基因组。
图4B：孤独症组的CpG位点甲基化变异度增加。
图注
图4A：每个CpG位点的差异甲基化绘制为：（孤独症组的平均甲基化百分比）减去（对照组的平均甲基化百分比），因此正值反映孤独症组相对于对照组的高甲基化。
图4B：
柱高:每个CpG点的中位方差(SEM)；
灰线:各CpG位点对照组与孤独症组的对应差异。
四、总结
一、小结
GABA能信号对维持神经回路的兴奋-抑制平衡至关重要，在孤独症等精神类疾病中经常会出现兴奋-抑制失衡现象。GAD1是调控GABA水平的关键基因，是评估兴奋-抑制平衡的关键生物标志物。
研究者关注GAD1的一个功能相关调控区域，发现孤独症组的脑类器官目标区域的DNA甲基化谱有异常。
此外，通过分析孤独症患者和正常人的甲基化模式，发现孤独症患者的脑类器官中GAD1甲基化谱丧失了规律性。
二、讨论
不同类型细胞的DNA甲基化模式不同，在大脑中也不例外，不同类型神经元亚群的基因也具有特定的甲基化特征，例如在兴奋性神经元和抑制性神经元之间就存在特定的甲基化差异。
既往对孤独症患者脑类器官的研究也表明这两种神经元内存在特异性的甲基化紊乱，这种紊乱是与孤独症疾病进展相关的。
鉴于GAD1能调控抑制性神经递质GABA水平，研究者推断GAD1参与特异细胞形成特有甲基化模式的过程。
因此，未来的研究方向可以对特异类型细胞的甲基化模式进行分析，进一步了解在孤独症患者神经发育过程中，DNA甲基化紊乱和靶向表观遗传修饰失调对孤独症患者的神经功能造成的影响。
此研究证明GAD1基因与孤独症相关，GAD1在孤独症患者胚胎发育阶段受到表观遗传调控。研究鉴定出六个潜在的GABA能生物标志物，其中三个位于功能相关的CTCF结合序列内。这些研究结果可以将表观遗传修饰紊乱与孤独症患者大脑内兴奋-抑制失衡联系起来。
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