癌症作为全球范围内的重大健康威胁，近年来引起了广泛的关注。尽管免疫检查点抑制剂等新型治疗方法取得了一定进展，但肿瘤微环境中的免疫抑制效应仍然是制约治疗效果的重要因素之一。特别是肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），它们在肿瘤微环境中占据了重要地位，能够促进肿瘤的生长、转移和治疗抵抗。因此，如何有效重编程TAMs以恢复其抗肿瘤功能成为了提高免疫治疗效果的关键科学问题。CRISPR-Cas9基因编辑技术因其精准的基因调控能力，在癌症治疗领域展现出了巨大潜力，但其体内应用面临细胞存活率下降和安全有效递送方式的挑战。
为解决上述挑战，南京大学生命科学院张峻峰，黄振，陈江宁团队开发了一种基于大肠杆菌原生质体衍生纳米囊泡（NVs）的CRISPR-Cas9系统，旨在靶向TAMs进行基因编辑。首先，构建表达Cas9-sgPik3cg复合物的大肠杆菌，通过去除高毒性的细菌外膜，形成含有大量Cas9-sgPik3cg核糖核酸蛋白复合物和富含CpG序列的细菌DNA片段的纳米囊泡。这些纳米囊泡通过一系列挤出步骤制备而成，并进一步用pH响应性磷脂衍生物（DHP）和特异性靶向TAMs的磷脂衍生物（DGA）进行表面修饰。DHP能够在肿瘤酸性微环境中释放PEG2000，促进DGA功能化的纳米囊泡被TAMs通过MGL受体介导的内吞作用识别和内化，从而实现TAMs特异性的基因编辑和TLR9活化，促使M2样TAMs向抗肿瘤的M1样表型转变。
通过电泳技术和PCR分析，研究发现原生质体衍生的纳米囊泡中DNA和RNA的大小分布比大肠杆菌更广但更小。流式细胞术结果显示，当每1×10^9 CFU原生质体中加入101.25 μmol DHP/DGA时，修饰效率达到最高。荧光共振能量转移（FRET）实验显示，FITC-DGA和RhB-DHP成功插入到了纳米囊泡的膜中。差示扫描量热法（DSC）实验观察到sgPik3cg-DHP/DGA-NVs在50.1°C时有一个相变温度峰，而自由NVs则没有，这进一步证实了DHP和DGA的成功结合。透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）结果表明，无论自由NVs还是sgPik3cg-DHP/DGA-NVs都表现出均匀的纳米级尺寸分布。
在MC38小鼠肿瘤模型中，sgPik3cg-DHP/DGA-NVs展示了高达76.4%的肿瘤生长抑制率，远超现有PI3Kγ拮抗剂如IPI549的疗效。Western blotting和酶活性测定结果表明，sgPik3cg-DHP/DGA-NVs比IPI549更有效地破坏了PI3K信号通路。经过sgPik3cg-DHP/DGA-NVs处理后，TAMs能够在10天内保持M1样抗肿瘤表型，即使在免疫抑制的肿瘤微环境中。此外，含有CpG序列的细菌DNA片段能够有效转移到巨噬细胞内部，激活TLR9信号通路，协同诱导巨噬细胞向M1样表型转化。使用TLR9缺失小鼠或TLR9信号抑制剂ODN2088部分逆转了sgPik3cg-DHP/DGA-NVs对巨噬细胞重编程及治疗效果的影响，进一步验证了其作用机制。
与外膜囊泡（OMVs）相比，大肠杆菌原生质体衍生的纳米囊泡表现出更高的生物安全性。所有接受静脉注射NVs的小鼠均未出现死亡现象，而OMVs处理组的小鼠则出现了死亡。此外，H&E染色和生化指标的安全性评估表明，非特异性编辑并未导致正常器官（如肝脏和脾脏）的显著炎症或组织损伤，突显了该基于囊泡治疗策略的安全性。
综上所述，本研究开发的sgPik3cg-DHP/DGA-NVs为癌症免疫治疗提供了一种创新且高效的方法。通过精确编辑TAMs中的特定基因，重塑肿瘤微环境，从而增强机体对肿瘤的免疫反应。未来，随着更多研究的深入，这一技术有望为癌症患者带来更加有效的治疗选择。
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https://doi.org/10.1038/s41467-024-44941-9
