诺贝尔奖背后的科学故事

发现微小RNA及其在转录后基因调控中的作用

多细胞生物从单细胞祖先进化而来，每种细胞类型都获得了专门的功能，这需要越来越复杂的基因调控机制。除了由作用于调控序列的 DNA 结合因子介导的转录基因调控外，随着生物体进化而来的复杂性不断增加，其他形式的控制系统也应运而生。数亿年来，编码微小非编码 RNA 分子（即所谓的 microRNA）的基因在多细胞生物的基因组内扩增，对 mRNA 稳定性和蛋白质翻译发挥转录后控制作用。直到 1993 年 Victor Ambros 和 Gary Ruvkun 发现 microRNA 及其基因调控模式之前，人们对此一无所知。这两位诺贝尔奖获得者研究了突变的秀丽隐杆线虫，这些线虫因 lin-4 和 lin-14 基因位点的改变而导致发育缺陷。Ambros 的实验室克隆了 lin-4 基因，并意外发现它不编码蛋白质。相反，它编码了一个 22 个核苷酸的短非编码 RNA。与此同时，Ruvkun 实验室确定 lin-4 通过其 3' 非翻译区 (3'UTR) 中的多个元素调节 lin-14。通过比较序列信息，他们确定了短非编码 lin-4 RNA 和 lin-14 的 3'UTR 元素之间的部分序列互补性。这让我们首次看到了一种概念上新颖的调节 RNA：microRNA。2000 年，Ruvkun 实验室发现了高度保守的 let-7 microRNA，随后在包括人类在内的各种动物物种中鉴定了同源 microRNA。这引发了对整个动物界的 microRNA 进行克隆和测序的激烈努力，最终发现 microRNA 包含一大群控制大量蛋白质编码基因网络的调节因子。Ambros 和 Ruvkun 的发现完全出乎意料，揭示了一种由微小 RNA 介导的进化保守的转录后调控机制，在动物发育和成人组织功能中发挥着关键作用。

介绍

控制每个基因何时何地转录为 RNA 并翻译成蛋白质是生命的一个基本方面（图 1）。例如，胰岛素在胰岛的 β 细胞中产生，而视蛋白则在眼睛的视网膜中产生。针对特定细胞类型的精确基因调控指令编码在遗传物质本身中，并由序列特异性的 DNA 结合蛋白起作用。François Jacob和Jacque Monod因发现基因调控方式而于 1965 年获得诺贝尔生理学或医学奖。DNA 结合转录因子库在单细胞和多细胞真核生物中得到了很好的保存（King  et al.，2008），而在多细胞生物中出现了额外的基因调控层，以确保在每种细胞类型中随时正确产生 RNA 和蛋白质。

真核生物模型生物对遗传学研究具有无价的价值，带来了许多意想不到的发现。悉尼·布伦纳在五十多年前引入了线虫 秀丽隐杆 线虫（C. elegans）。这种生物的繁殖周期短、透明度高，并且易于进行基因操作，因此促进了广泛的研究。悉尼·布伦纳、约翰·苏尔斯顿和罗伯特·霍维茨利用 秀丽隐杆线虫 揭示了在器官发育过程中细胞分裂、分化和细胞死亡是如何受到基因控制的，他们因这一发现获得了 2002 年诺贝尔生理学或医学奖。

20 世纪 70 年代，   Brenner 实验室对 秀丽隐杆线虫进行的诱变筛选发现了lin-4 突变体 (e912)。这些线虫表现出惊人的表型：许多细胞类型和形态结构完全缺失，由于外阴发育失败而积聚卵子（图 2）（Horvitz 和 Sulston，1980 年；Chalfie、Horvitz 和 Sulston，1981 年），似乎是特定细胞谱系发育程序的重复。

在lin-4突变体中观察到的线虫发育严重中断表明lin-4编码了发育时间的主要调节器。大量表现出各种时间发育缺陷的额外异时性突变体被鉴定出来，包括 Horvitz 实验室发现的第二个突变体lin-14（Ferguson、Sternberg 和 Horvitz，1987 年）。

图 2. 具有发育缺陷的异时性线虫突变体。线虫lin-4和lin-14突变体动物发育受到干扰。突变的lin-4线虫重申了细胞谱系的发育程序，以积累内部卵子而不形成阴户，而lin-14突变体较小且缺乏幼虫发育。 

与此同时，Victor Ambros 在David Baltimore的指导下攻读了脊髓灰质炎病毒基因组结构和复制方面的博士学位，随后加入了 Horvitz 实验室。在攻读博士后期间，Ambros 立即着手对异时性突变体进行基因分析，并发现lin-14具有与lin-4突变体中观察到的相反的发育时间缺陷（图 2）。在lin-14突变体中，幼虫程序完全缺失（Ambros 和 Horvitz，1984 年）。值得注意的是，Ambros 后来发现lin-4是lin-14的负调节因子（Ambros，1989 年）。

在此期间，加里·鲁夫昆在弗雷德里克·奥苏贝尔的指导下完成了细菌遗传学博士学位。在欧洲旅行时，他在了解了异时性突变体的细胞谱系分析后对蠕虫遗传学产生了浓厚的兴趣（Chalfie、Horvitz 和 Sulston，1981 年；Ruvkun、Wightman 和 Ha，2004 年）。随后与马丁·查尔菲和罗伯特·霍维茨的讨论进一步激发了他对使用秀丽隐杆线虫研究这些问题的兴趣。1982 年，鲁夫昆开始在沃尔特·吉尔伯特和罗伯特·霍维茨的实验室联合进行博士后研究。

通过 microRNA 发现转录后基因调控

在 Horvitz 实验室，Ambros 和 Ruvkun 开始了克隆lin-14 的长期探索。当时，确定由遗传学定义的基因座的 DNA 序列是一项艰巨的任务。经过多年的坚持不懈的实验，他们使用经典的限制性片段长度多态性方法成功确定了该区域（Ruvkun等人，1989 年）。在此期间，Ambros 和 Ruvkun 都获得了教职，Ambros 在哈佛大学，Ruvkun 在麻省总医院和哈佛医学院。他们致力于解决自己的问题，继续进行分子分析。Ruvkun 证明 lin-14 是一种在发育过程中具有阶段特异性表达的核蛋白，在 L1 阶段表达较高，并在lin-4和lin-14突变体中发生改变（Ruvkun 和 Giusto，1989 年）。有趣的是，人们发现了lin-14获得功能突变体，其中 3'UTR 被删除（Ruvkun 和 Giusto，1989 年；Wightman等人，1991 年），导致 lin-14 蛋白检测时间延长至 L1 阶段之后（Arasu、Wightman 和 Ruvkun，1991 年；Wightman等人，1991 年）。3'UTR 元件的破坏对蛋白质序列没有影响，因此 Ruvkun 推测，作用于 mRNA 稳定性、核输出或翻译的转录后机制可能介导了lin-14中的时间转换（Wightman等人，1991 年）。

与已鉴定的几种lin-14突变体不同，在lin-4中仅发现了一种突变体 (e912)。Ambros 实验室着手克隆lin-4基因，以限制性片段长度多态性和南方印迹探测为指导。他们“沿着染色体行走”并反复测试较小的基因组片段，看它们能否挽救突变的lin-4表型，最后确定了一个 693 bp Sal ll限制性酶片段。经过多轮开放阅读框预测和克隆重新测序以排除错误后，他们开始怀疑lin-4基因可能是非编码 RNA，因为它的开放阅读框 (ORF) 序列较短。引入秀丽隐杆线虫序列的移码突变不会影响lin-4功能，证实了这一怀疑。1991年，该实验室开始通过Northern印迹和RNase保护试验探测lin-4转录本，发现了两个长度分别为61个和22个核苷酸（nt）的短RNA转录本（图3）。

图 3. 两种短 lin-4 转录本的鉴定。野生型、lin-4 (e912) 突变体和用 Sal I 片段拯救的lin-4 (e912) 突变体的总 RNA 的 Northern 印迹，用放射性标记的lin-4 RNA 探针进行探测，并与 U6 上样对照进行比较。 

1992 年 6 月 11 日晚上，Ambros 和 Ruvkun 分别独立推导出 lin-4  （Ambros 实验室）和 lin-14 （Ruvkun 实验室）的序列，并交换了lin-4 和 lin-14 基因的序列数据。两人都注意到 lin-4非编码 RNA 与lin-14  3'UTR 中的多个元件 之间存在明显的部分互补性（图 4）。

意识到这一观察的重要性后，这两个实验室进行了一系列额外的实验，证明 lin-4  microRNA 通过与位于 3'UTR 中的元素进行碱基配对来调节 lin-14  mRNA。1993 年，他们连续在《细胞》杂志上发表两篇论文，报道了这一开创性的发现（Lee, Feinbaum 和 Ambros，1993 年；Wightman, Ha 和 Ruvkun，1993 年）。

图 4. lin-4和lin-14 RNA中的互补序列元素。通过比较lin-4和lin-14的克隆序列，我们发现短的 22 nt lin-4 RNA 与lin-14 3'UTR中的重复元素具有部分互补性。 

Ambros 实验室利用 秀丽隐杆线虫 lin-4 序列  在其他线虫物种（C. briggsae、  C. remanei 和 C. vulgaris ）中识别出相应的含有lin-4的克隆。这些实验表明，  来自其他线虫的 lin-4克隆可以挽救秀丽隐杆线虫中的lin-4 突变表型 。他们还筛选了超过 20,000 条诱变染色体，以识别出第二个 lin-4 突变体 (ma161)，其中包含一个单核苷酸突变。值得注意的是，该突变存在于互补序列中，进一步支持了 lin-4  microRNA 和 lin-14  3'UTR 元件之间互补碱基的功能意义（Lee、Feinbaum 和 Ambros，1993 年）。

Ruvkun 实验室比较了野生型和 lin-14 获得功能突变体中 lin-14 蛋白质和 RNA 的量。突变体中的 Lin-14 蛋白质增加了 4 到 7 倍，而 RNA 量没有差异，表明 lin-14 在转录后水平（即 RNA 转录后）受到调控。将 lin-14  3'UTR 转移到报告基因中会导致报告基因的转录后调控类似于 lin-14，表明异源 3'UTR 足以控制 mRNA 翻译。反复将 lin-14  3'UTR 的较小片段转移到报告基因中，直到鉴定出具有功能的 124 nt 长的 3'UTR 片段。该 3'UTR 区域含有几个与lin-4部分互补的序列 ，并且该区域在 C. briggsae中是保守的 （Wightman、Ha 和 Ruvkun，1993）。

对新发现的 lin-4  microRNA 进行计算机分析，将其与来自所有物种的核苷酸序列综合数据库进行对比，发现只有其他秀丽隐杆线虫（例如 C. briggsae）才有匹配的序列。一个关键问题仍然存在：microRNA 的存在是线虫独有的特性，还是在整个动物界中都具有深远的功能影响？

发现进化保守的 let-7 microRNA

在第一个 microRNA lin-4突破性地发现之后 ，七年后，第二个 microRNA 基因 let-7才被发现。Ruvkun 实验室进行了基因筛选，重点寻找能够抑制 lin-14 和 egl-35 基因座突变菌株的合成不育表型的突变体 (Reinhart 等人，2000)。 发现Let-7 编码一个短的 21 nt RNA，该 RNA 与各种异时基因的 3'UTR 互补，包括 lin-14、  lin-28、  lin-41、  lin-42 和 daf-12。let -7的缺失  导致成虫阶段幼虫细胞命运的重复。第二个 microRNA 基因的发现表明 microRNA 可能在调节发育过程中细胞谱系形成的阶段特异性时间方面发挥更广泛的作用。

下一个突破是，Ruvkun 实验室发现 let-7 基因与lin-4不同 ，它在多种动物中都是进化保守的。将 let-7  microRNA 序列与核苷酸数据库进行比较，发现在果蝇和人类中都有匹配的序列（Pasquinelli 等人，2000 年）。let -7 在线虫中 已确定的一个靶标 是 lin-41（Reinhart等人，2000 年），这是一种在斑马鱼和果蝇中都有直系同源物的蛋白质。令人欣慰的是，斑马鱼和果蝇 lin-41直系同源物的 3'UTR 都与let-7 互补  （Pasquinelli 等人，2000 年）。此外，  let-7  microRNA 存在于多种人体组织中，表明其与哺乳动物细胞中的基因表达普遍相关。

与线虫类似，对果蝇发育的分析表明 let-7 microRNA 具有时间调控作用，这表明let-7 在昆虫、甲壳类动物和线虫中  具有保守作用 (Pasquinelli等人，2000)。引人注目的是，  即使在软体动物和环节动物的成体阶段也检测到了 let-7 的时间表达 (Pasquinelli等人，2000)，这些物种不会通过幼虫阶段发育。此外，脊椎动物没有明显的幼虫阶段，但在发育过程中表现出时间调控的 let-7 表达，包括在成年斑马鱼中强烈表达。令人惊讶的是， 发现let-7 表达在两侧对称动物（即具有左右对称的动物）中受到时间调控，并且可能是在这些动物与双胚层物种（即从两个原发胚层而不是三个发育而来，就像人类和其他脊椎动物一样）分化之后进化而来的（图 5）。进化上高度保守的 let-7的发现 大大增加了人们对 microRNA 作为基因表达的转录后调节剂的兴趣。

图 5. let-7 RNA 表达和 microRNA 的进化保守性。左图：后生动物进化树，突出显示可检测到 let-7 microRNA 表达 (+) 或未检测到let-7表达 (-) 的树分支。具有类似 let-7 RNA 表达发育模式的物种（早期无 let-7；但成年期有 let-7 表达）用“Dev.”表示。（Pasquinelli 等人，2000 年）。右图：microRNA 基因已在多细胞生物基因组中进化和扩展了 5 亿多年。

发现 let-7之后，一些研究实验室试图通过小 RNA 克隆来鉴定人类和其他物种中的更多 microRNA。Thomas Tuschl 实验室从人类和果蝇组织中克隆了新的 microRNA（Lagos-Quintana 等人，2001），David Bartel 实验室从线虫中分离出了新的 microRNA（Lau 等人，2001），Ambros 实验室也做了同样的事（Lee 和 Ambros，2001）。现在，综合证据令人信服：大量调节性 microRNA 存在于动物中，可能在基因调控中发挥重要作用。分子生物学和测序技术的进步已导致在人类基因组中鉴定出超过一千个 microRNA 基因。目前，microRNA 基因数据库 miRBase 包含 271 种生物的 38,000 多个发夹结构前体和 48,860 个成熟 microRNA 基因序列 (Kozomara、Birgaoanu 和 Griffiths-Jones，2019 年)。甚至病毒也被发现编码 microRNA 基因 (Pfeffer 等人，2004 年)。

随着更多 microRNA 的克隆和全基因组序列的可获得性，我们越来越有可能确定 microRNA 和 3'UTR 区域之间的碱基配对规则。David Bartel、Christopher Burge 和 Stephen Cohen 实验室进行的关键研究（Lewis 等人，2003 年；Stark 等人，2003 年；Brennecke 等人，2005 年；Lewis、Burge 和 Bartel，2005 年）通过结合实验和比较基因组学方法，阐明了 microRNA 靶标识别的总体规则。这些研究表明，microRNA 通常与靶标 mRNA 具有部分互补性，主要在 microRNA“种子”区域。这项工作还揭示了每个 microRNA 可能调控多个蛋白质编码基因，因为许多 3'UTR 表现出与 microRNA 种子序列互补的序列的过度保守性（Brennecke 等人，2005 年；Lewis、Burge 和 Bartel，2005 年）。有趣的是，与细胞类型或谱系特异性 microRNA 共表达的基因缺乏该特定 microRNA 的靶位点。相反，此类 microRNA 靶位点在邻近细胞和组织中表达的基因中很常见（Farh 等人，2005 年；Stark 等人，2005 年）。这些观察结果强化了以下假设：microRNA 在多细胞生物的细胞谱系形成和细胞类型稳定性中发挥重要作用。

MicroRNA 的生物合成和功能

在克隆其他 microRNA 基因的同时，多个研究小组也投入了大量精力来了解 microRNA 的生物合成和作用机制 (Bartel, 2004)。microRNA 基因转录的策略各不相同。许多 microRNA 基因是独立的转录单位，有时聚集在一起，而其他基因则位于蛋白质编码基因的内含子内。典型的初级 microRNA (pri-microRNA) 由 RNA 聚合酶 II 转录，具有发夹结构序列。该发夹结构可作为微处理器在细胞核中处理的底物，微处理器是一种含有 Drosha 内切酶的异三聚体复合物，可切割两条链以产生前体 microRNA (pre-microRNA)，通常长 60-70 个核苷酸，最早在 Ambros 实验室检测到（图 2）。Exportin 5 和 RAN-GTP 促进前体 microRNA 转运到细胞质。随后，Dicer（一种最初在 Greg Hannon 实验室中发现的核酸内切酶，Bernstein 等人，2001 年）对其进行加工，形成 microRNA 双链。有效的 microRNA 链被加载到含有 Argonaute 蛋白的沉默复合物上，而另一条“乘客”链则被取代（Schwarz 等人，2003 年）。一旦 microRNA 链被加载到沉默复合物中，它就可以通过减少翻译和/或 mRNA 降解对 mRNA 进行序列特异性负调控。这种调节涉及衔接蛋白 TNRC6 和 poly(A) 结合蛋白 PABPC，它们会募集脱腺苷酸酶复合物来缩短 mRNA polyA 尾巴，从而导致 mRNA 降解和翻译抑制，具体取决于细胞环境，例如发育阶段和细胞类型。

处理和执行 microRNA 功能的机制也用于其他基于 RNA 的沉默机制，通常称为 RNA 干扰 (RNAi)。这些机制包括小干扰 RNA (siRNA)、内源性 piwi 相关 RNA (piRNA) 和重复相关小干扰 RNA (rasiRNA)。双链 RNA 可以诱导序列依赖性基因沉默 (Fire 等人，1998)的发现让Andrew Z. Fire和Craig C. Mello获得了2006 年诺贝尔生理学或医学奖。RNAi 主要用作防御病毒感染（在植物和复杂程度较低的动物中）和有害基因组移动元件活动的机制，而 microRNA 则在整个发育过程中以及在各种成体细胞类型中对 mRNA 施加转录后控制。为此，microRNA 已进化出与其靶 mRNA 序列的部分互补性，以“调整”对每个 mRNA 靶标的各自影响，而 siRNA 通常是外源性的，与被切割的特定 RNA 靶标序列完全互补。1999 年，David Baulcombe 表明，植物中的转录后基因沉默涉及对靶标序列具有特异性的短 RNA 的加工（Hamilton 和 Baulcombe，1999 年），进一步将不同领域的观察结果联系起来。

microRNA 的进化及其生理作用

microRNA 基因的出现和扩增与更复杂生物的进化密切相关（图 5）。在早期两侧对称动物进化过程中，microRNA 基因的数量显著增加（Grimson 等人，2008；Wheeler 等人，2009），其功能作用在原口动物和后口动物分化之前的最后的共同两侧对称动物祖先中推断出来（Christodoulou 等人，2010）。此后，随着复杂生物中更专业化的细胞类型和组织的进化，获得了数百种额外的 microRNA 基因。甚至在早期的后生动物海绵、植物和两种单细胞真核生物中也发现了 microRNA 基因。因此，microRNA 可能在进化过程中出现多次，包括大约 6 亿年前多细胞动物的早期谱系，或者植物和动物的祖先早在 10 亿年前就进化出了 microRNA（Moran 等人，2017）。值得注意的是，许多进化上古老的 microRNA 基因在后来进化的生物体中得以保留，而且这些基因在进化过程中很少丢失，这证明了它们在基因调控中的关键作用。

通过消除 microRNA 生物合成途径中的成分，已证实了 microRNA 在后生动物发育和组织功能中的重要作用。Dicer 负责处理细胞质中的前 miRNA，而 Dicer 的缺失会导致小鼠和斑马鱼的胚胎死亡 (Bernstein 等人，2003；Wienholds 等人，2003)。在果蝇和小鼠中，单个或一组 microRNA 基因的去除也会导致强烈的表型 (Bartel，2018)。然而，单个 microRNA 基因的作用可能被掩盖，这可能是由于多个 microRNA 基因具有冗余作用，这些基因共享靶标定义种子序列。虽然系统中的冗余代表了研究单个 microRNA 基因功能的障碍，但它也证明了系统的稳健性，并解释了为什么它不能轻易被病毒等操纵。

为了强调 microRNA 的根本作用，需要注意的是，进化上最保守的 microRNA 基因（即两侧对称动物共有的基因）在胚胎发育早期发挥作用，而专门在哺乳动物中进化的 microRNA 则在胚胎发育的后期发挥作用（DeVeale、Swindlehurst-Chan 和 Blelloch，2021 年）。相比之下，物种特异性 microRNA 基因通常在成体细胞类型中发挥作用，而不是在胚胎发育中发挥作用。这些模式从对进化保守性不同的 microRNA 基因进行的系统敲除实验中可以看出。microRNA 在动物发育过程中的具体调控作用包括发育时间、细胞命运的形成和稳定性、一般生理学和体内平衡（DeVeale、Swindlehurst-Chan 和 Blelloch，2021 年）。

通过选择性去除转基因小鼠中的 Dicer，已阐明了 microRNA 在成人细胞和组织中的功能。  在 B 细胞成熟过程中 早期去除Dicer1导致分化在前 B 细胞阶段停止 (Koralov等人，2008)。 在胚胎第 15.5 天时，神经元中的Dicer1消融 导致出生后早期死亡，随后出现小头畸形、树突分支细化减少和树突棘长度增加 (Davis 等人，2008)。在有丝分裂后的小脑浦肯野细胞中，  两周龄时 Dicer1 的缺失引发了小脑退化和共济失调发作（肌肉运动不协调）（Schaefer等人，2007）。类似地，中脑多巴胺能神经元中Dicer1的缺失  导致进行性神经元丢失和运动能力下降 (Kim  et al. , 2007)。在其他几种细胞类型和组织中也观察到了严重的表型，证明了 microRNA 在发育过程和成体细胞类型功能中的关键作用。

microRNA 对人类发育和功能的重要性通过与特定 microRNA 基因或生物发生途径成分突变相关的综合征变得显而易见。DICER1 综合征是一种由 DICER1 基因突变引起的罕见遗传性疾病，该综合征使患者易患肾脏、甲状腺、卵巢、宫颈、睾丸、脑、眼和肺肿瘤。通常，  DICER1的一个等位基因 会发生生殖系突变，导致其失去功能，从而降低细胞中功能性 DICER1 蛋白的数量。这些个体容易受到其他体细胞突变的影响，因此经常在儿童时期患上肿瘤（Foulkes、Priest 和 Duchaine，2014 年）。

单个 microRNA 基因的碱基配对部分（即种子区域）较短，因此不太可能因偶然突变而改变。然而，microRNA 基因种子序列中存在已知与疾病相关的突变。这些包括与进行性听力损失相关的 miRNA-96 突变（Mencía 等人，2009 年；Soldà 等人），导致 EDICT 综合征的 miRNA-184 突变，这是一种罕见的眼部疾病，表现为虹膜发育不全、内皮营养不良和先天性白内障（Hughes 等人，2011 年；Iliff、Riazuddin 和 Gottsch，2012 年；Lechner 等人，2013 年），以及导致先天性骨骼疾病的 miRNA-140-5p 突变（Grigelioniene 等人，2019 年）。基于 microRNA 的诊断和治疗方法在代谢紊乱、心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等疾病的开发方面正在取得进展。

总结

得益于 Ambros 和 Ruvkun 的开创性发现，以及许多同事在他们的发现的基础上继续研究，基因调控的一个新维度被揭示出来。细胞核中的蛋白质调节 RNA 的转录和剪接，而 microRNA 则控制细胞质中 mRNA 的翻译和降解。这一意想不到的转录后基因调控层在整个动物发育过程中以及在成年细胞类型中都至关重要，对于复杂的多细胞生命至关重要。

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