晚期非小细胞肺癌液基细胞学标本的分子检测评估和疗效评价

肺癌是我国发病率和死亡率均位居首位的恶性肿瘤。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占85%，70%的患者就诊时已处于晚期。晚期患者预后差，常规采用铂类药物为基础的化疗方案治疗，患者的2年生存率仅为11%。随着分子技术的进展，靶向药物逐渐应用于临床一线。Ⅳ期原发性肺癌中国治疗指南(2020年版)指出：晚期NSCLC应在诊断的同时常规进行表皮生长因子受体(epidermal growth factor recptor, EGFR)基因突变和间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因检测，必要时可进行鼠类肉瘤病毒癌基因(kisten ratsarcoma riral oncogene homolog, KRAS)、鼠类肉瘤过滤性毒菌致癌同源体B(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, BRAF)等基因检测，根据检测结果决定治疗方案。具有基因敏感突变的患者应用相应靶向药物治疗，在总生存时间(overall survival, OS)、无进展生存时间( progression-free survival, PFS)和生活质量等方面具有更显著的优势。组织学标本的基因检测是肺癌分子诊断的金标准，由于晚期NSCLC已失去手术机会，难以取得组织学标本，相当一部分患者的诊治要依靠细胞学标本完成。细胞蜡块标本的基因检测已有诸多报道，但对于固定、制片等与细胞蜡块完全不同的液基细胞学标本的基因检测，根据其检测结果应用相应靶向药物治疗的疗效如何，国内外仍缺乏大样本临床研究数据。液基细胞学是将细胞固定于特殊的保存液中形成悬浮液，使标本比传统涂片能更长时间保存的一种制片方式。在本研究中，我们采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)对412例晚期NSCLC的液基细胞学标本进行EGFR、KRAS和BRAF基因突变检测，并评估其靶向治疗疗效，旨在探讨采用液基细胞学标本进行基因突变检测以指导临床治疗的可靠性。

资料与方法

1．临床资料：

收集2015年3月至2017年4月中国医学科学院肿瘤医院412例晚期NSCLC患者的液基细胞学标本和临床资料，其中男196例，女216例，年龄52~91岁，中位年龄为61岁。其中32例患者有手术后组织病理切片或组织活检标本，作为组织学标本对照，包括20例肺癌原发灶标本，11例肺癌淋巴结转移活检切除标本，1例肺癌肝转移穿刺标本。所有标本均经组织病理或免疫细胞化学检测证实，腺癌398例，非腺癌14例。

2．细胞学标本采集及制片：

(1)体液标本：209例，包括胸水、腹水及心包积液。将体液标本离心，弃去上清液，将细胞层移入液基保存液内，制备液基薄片。(2)细针吸取(fine needle aspiration, FNA)标本：185例。用23G一次性注射器(针头规格0.7 mm)吸取转移淋巴结等，将吸出物制作传统涂片和液基薄片各1张。(3)纤维支气管镜(fibreoptic bronchoscope, FOB)刷检标本：18例。在纤维支气管镜下，使用毛刷刷取黏膜组织，然后洗入液基保存液内，制备成液基薄片。

3．RT-qPCR检测基因突变：

液基细胞学标本和组织标本均经细胞学医师确诊为NSCLC后，计数肿瘤细胞百分比。肿瘤细胞数量≥200个、肿瘤细胞百分比≥20%的标本入组。使用QIAamp^® DNA mini试剂盒(德国Qiagen公司)，按说明书提取DNA，应用微量紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度。使用商品化的人EGFR、KRAS和BRAF基因突变检测试剂盒进行检测，具体操作步骤按说明书进行，并根据说明书上的判定标准对PCR反应扩增曲线和CT值进行分析。

4．酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)治疗的疗效评价：

通过电子病案系统查阅患者病历，获取患者的临床和随访资料。截至2021年5月26日，412例患者中142例有临床应用EGFR-TKI治疗的记录，对这142例患者进行EGFR-TKI治疗的近期和远期疗效评价。EGFR-TKI治疗的近期疗效评价采用实体瘤的疗效评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST)1.1版。疾病控制率(disease control rate, DCR)定义为完全缓解(complete remission, CR)+部分缓解(partial remission, PR)+疾病稳定(stable disease, SD)患者例数占患者总例数的百分比。无进展生存时间(progression-free survival, PFS)定义为从治疗开始至疾病进展或任何原因所致死亡的时间。

5．统计学方法：

应用SPSS 21.0软件进行统计分析。组间率的比较采用χ²检验和Fisher精确概率法。对液基细胞学标本与组织学标本基因检测结果进行一致性检验，Kappa<0.20表示二者完全不一致，Kappa为0.21~0.40表示一致性一般，Kappa为0.41~0.60表示一致性中等，Kappa为0.61~0.80表示大体一致，Kappa为0.81~1.00表示完全一致。生存分析采用Kaplan-Meier法，并绘制生存曲线，两组间生存率的比较采用Log rank检验。检验水准α＝0.05。

结  果

1．液基细胞学标本的EGFR、KRAS和BRAF基因突变检测结果：

412例NSCLC液基细胞学标本中，216例发生EGFR突变，突变率为52.4%。EGFR突变以19外显子Del突变和21外显子L858R突变为主，分别占42.6%(92/216)和37.5%(81/216；表1，图1)。36例发生KRAS基因突变(图2)，突变率为8.7%。KRAS突变以G12C突变为主，占41.7%(15/36，表2)。3例发生BRAF基因突变(图3)，突变率为0.7%，均为15外显子V600E突变。

2．EGFR、KRAS和BRAF基因突变与NSCLC临床病理特征的关系：

EGFR突变与性别、病理类型、标本来源有关，其中女性患者EGFR突变率(63.0%)高于男性患者(40.8%，P<0.001)，腺癌EGFR突变率(54.3%)，高于非腺癌(0.0%，P<0.001；表3)。KRAS突变与性别有关，男性突变率(12.2%)高于女性(5.6%，P＝0.016；表3)。BRAF基因突变率与性别、年龄、病理类型、TNM分期和标本来源均无关(均P>0.05；表3)。

3．多基因突变患者的临床病理特征：

412例标本中，有3例发生了EGFR、KRAS和BRAF基因的多基因突变，均为Ⅳ期男性腺癌患者(表4)。

4．液基细胞学标本与组织学标本基因突变的一致性：

32例同时有液基细胞学标本与组织学标本的患者中，30例患者的液基细胞学标本与组织学标本基因检测结果一致(Kappa＝0.91)。具体检测结果见表5，其中12例组织学与液基细胞学标本均来自转移灶，基因检测结果完全一致(Kappa＝1.00)，其中包括5例肺癌淋巴结转移活检切除标本与细针针吸细胞学标本；19例组织学标本来自肺部原发灶、液基细胞学标本来自转移灶，18例基因检测结果一致(Kappa＝0.92)，基因检测结果不一致的1例，原发灶组织学标本基因检测为野生型，转移胸水细胞学标本为EGFR基因19del和T790M突变；另外1例患者的组织学标本为左肺下叶组织活检标本，发生了EGFR基因21号外显子L858R突变，细胞学标本来自同侧肺上叶FOB刷检标本，发生了18号外显子G719C和G12V突变。

5．TKI药物治疗疗效：

142例临床应用EGFR-TKI治疗的患者中，127例液基标本检测为EGFR突变型，15例液基标本检测为EGFR野生型。使用埃克替尼59例，吉非替尼57例，厄洛替尼20例，奥西替尼和西莫替尼各2例，康尼替尼和阿法替尼各1例。

127例EGFR突变患者中，有27例因缺少本院影像学资料无法进行疗效评价，其他100例患者能评价疗效，其中CR 1例，PR 53例，SD 35例，疾病进展(progressive disease, PD)11例，DCR为89.0%。液基标本的来源与TKI药物治疗疗效无关(P＝0.941，表6)。15例EGFR野生型患者中，13例能评价疗效，其中SD 4例，PD 9例，DCR为30.8%。突变型和野生型患者的DCR差异有统计学意义(χ²＝22.93，P<0.001)。

127例EGFR突变型使用TKI治疗患者的中位PFS为13.8个月(95% CI：10.97~16.63)，15例EGFR野生型使用TKI治疗患者的中位PFS为1.4个月(95% CI：0.90~1.91)，两组差异有统计学意义(χ²＝61.19, P<0.001；图4)。

讨  论

近年来，NSCLC的个体化治疗发展迅速，分子分型是NSCLC实施个体化治疗的前提。获取基因检测标本国际上趋于采取创伤小、患者痛苦少的方法。相对于组织学标本，细胞学标本具有取材容易、对患者创伤小、可重复性强等特点，而且液基细胞学标本能够长时间保存，尤其是对于晚期NSCLC患者，细胞学标本不失为基因检测的候选标本。

有研究表明，肺癌液基细胞学检测的EGFR基因突变率为37.7%~50.5%，组织学标本检测的EGFR基因突变率为35%~55%。本研究显示，412例NSCLC液基细胞学标本采用RT-qPCR检测的EGFR突变率为52.4%，略高于既往研究的液基细胞学标本EGFR基因突变率，这可能与我们对液基细胞学标本质控严格，同时应用灵敏度较高的检测技术有关。不同来源细胞学标本的EGFR基因突变率从33.3%到100.0%不等，其中突变率最高脑脊液标本仅1例，突变率最低的浅表皮下结节穿刺标本仅3例，不具有代表性。FOB刷检标本的EGFR基因突变率达66.7%(12/18)高于体液标本(59.6%，124/208)和浅表及纵隔淋巴结标本(42.9%，78/182)，体液标本和浅表及纵隔淋巴结标本的EGFR基因突变率与既往文献报道一致。体液标本的EGFR基因突变率高于淋巴结穿刺标本可能与体液标本主要以胸腔积液为主，而肺腺癌是恶性胸腔积液中最常见的病理类型有关；同时，肿瘤原发灶与转移灶之间存在一定的异质性，胸水中常含有原发灶肿瘤细胞凋亡或坏死后释放的DNA，因此胸水基因检测更能反映原发灶的基因突变情况。

NSCLC患者最常见的EGFR突变是第19外显子缺失和第21外显子L858R点突变，约占所有EGFR突变的90.0%。一项对5125例中国NSCLC患者的研究显示，EGFR基因突变率为36.2%，以19Del和L858R突变为主(分别占48%和45%)，多发生在女性、非吸烟的腺癌患者中。本研究中的NSCLC液基细胞学标本，同样以EGFR基因19Del和L858R突变最常见(分别占42.6%和37.5%)，多见于女性和腺癌患者。

亚洲NSCLC患者的KRAS基因突变率为8%~10%。KRAS突变多发生在老年、男性、吸烟、肿瘤体积较大的腺癌患者，主要突变类型为G12C(27.2%)、G12D(27.0%)及G12V(22.3%)。本研究显示，KRAS基因突变率为8.7%，以男性为主，突变类型主要为G12C(41.7%)。BRAF基因突变的突变类型主要为V600E，突变率为1%~2%，主要发生在女性、吸烟患者。本研究显示，BRAF基因突变率为0.7%，均为V600E突变。

有学者在早期认为EGFR与KRAS和BRAF突变往往是互斥的，但近年来越来越多的研究表明，NSCLC患者中存在多基因共突变现象，且第2种基因突变的存在往往是发生EGFR-TKI药物治疗抵抗的原因。在本研究中，有3例患者存在多基因突变，其中1例为EGFR T790M和KRAS G12D突变，T790M突变在靶向药物治疗前即存在；1例为EGFR G719C和KRAS G12V突变；1例为EGFR 19del+T790M突变和BRAF V600E突变，T790M突变出现在靶向药物治疗后。3例多基因共突变患者TNM分期均为Ⅳ期，提示对于NSCLC患者初诊时就应该同时进行多种基因的检测。由于肿瘤在进展过程中有出现二次突变的可能，因此后期应根据病情追加基因检测，从而实现精准治疗。

本研究中有32例组织学匹配标本，基因检测结果显示，细胞学和组织学标本基因检测的一致性很高(Kappa＝0.91)。12例同一转移病灶的细胞学和组织学标本基因检测结果完全一致(Kappa＝1.00)，证明了液基细胞学基因检测结果的可靠性。Chang等认为，同一患者的原发灶和转移灶EGFR基因突变存在不一致的情况。本研究中19例来自原发灶的组织学标本和来自转移灶的细胞学标本，18例基因检测结果一致，有1例基因检测结果不同(Kappa＝0.92)。有1例原发灶为野生型而胸水转移灶为19del+T790M共突变。这明确显示了肿瘤的异质性，提示晚期NSCLC在转移过程中及接受治疗后，肿瘤细胞可能通过克隆演进使基因发生突变，进而影响靶向治疗的有效性。

多项大样本的临床研究表明，经组织学标本检测出EGFR突变的晚期NSCLC患者，使用EGFR-TKI药物治疗后，中位PFS可以达到9.2~18.9个月。但鲜有针对液基细胞学标本检测EGFR突变阳性患者使用EGFR-TKI药物治疗效果的大样本临床研究。Wu等报道，78例液基细胞学检测EGFR突变阳性的NSCLC患者，使用EGFR-TKI药物治疗的中位PFS达18个月。鲁涛等依据胸水细胞块行EGFR基因突变检测的结果，将132例晚期NSCLC患者分为阳性组(72例)和阴性组(60例)，两组使用EGFR-TKI药物治疗的DCR分别为95.8%和0%，中位PFS分别为11和1个月，差异均有统计学意义(均P<0.05)。在本研究中，我们观察了142例应用EGFR-TKI药物治疗的晚期NSCLC患者，其中127例EGFR突变阳性患者的DCR高达89.0%，中位PFS为13.8个月；15例EGFR突变阴性患者的DCR为30.8%，中位PFS仅1.4个月，差异均有统计学意义(均P<0.001)，充分证明了基因检测和分子分型的重要性。

综上所述，根据液基细胞学标本的有关基因检测结果对晚期NSCLC患者进行分子分型后，应用EGFR-TKI靶向药物治疗，能够获得很好的疾病控制率和无进展生存获益，充分证明了液基细胞学基因检测结果对临床靶向治疗的可靠性，细胞学标本可能成为晚期肺癌患者基因检测的重要标本来源。同时，随着靶向药物的应用和肿瘤进展，液基细胞学检测能方便、直接地识别获得性突变，从而指导临床进行更加合理的个体化治疗。

参考文献略。

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