RNA介导的CRISPR-Cas13系统的结构、机制及应用
文摘
科学
2024-08-16 13:28
浙江
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原核生物通常具有多种抵抗入侵的策略，以便在频繁的病毒攻击或侵入的遗传元件中生存。其中，CRISPR-Cas监测系统已进化得十分丰富，并得到了广泛的研究。其中备受关注的CRISPR-Cas
VI型Cas13系统便成为了研究的热点，该系统通过靶RNA引导Cas13内切酶激活其顺式和反式切割活性，可以降解外源RNA，从而提供适应性免疫。值得注意的是，与DNA引导的Cas9和Cas12系统不同，Cas13具有RNA激活的RNase活性。该文从蛋白质结构、生化和细胞生物学等方面入手，旨在阐述Cas13系统中效应复合物形成、前体crRNA（pre-crRNA）加工、自我区分和RNA降解的独特结构和机制原理，以及噬菌体编码的抗CRISPR蛋白的抑制和内源性辅助蛋白的调控。该综述的第一作者为中国科学院生物化学与细胞生物学研究所的杨辉研究员，第二作者为世界知名结构生物学家Dinshaw
J. Patel。
1. CRISPR-Cas13系统发生适应性免疫的机理
与DNA靶向的Cas系统不同，RNA靶向系统可以通过病毒DNA的单次切割来抑制病毒复制。靶向RNA的VI型CRISPR-Cas Cas13效应物监测宿主细胞中的RNA，并寻找与crRNA间隔区域互补的RNA靶标。除了降解结合RNA靶标外，Cas13还被结合RNA靶标激活，从而诱导非特异性底物单链RNA (ssRNA)的附带降解（图1）。首先，在初始的适应阶段，来自噬菌体或入侵质粒的短DNA片段（称为原间隔片段）被整合到宿主CRISPR阵列的前端，以创建新的间隔序列，从而提供先前感染的免疫记忆。在随后的表达阶段，CRISPR阵列被转录成单个非编码RNA，称为pre-crRNA，并由相关的Cas蛋白或非Cas宿主的RNases进一步加工，生成单个成熟的CRISPR-RNA （crRNA），每个crRNA携带一个间隔序列和一个相邻的重复序列。在最后的干扰阶段，由成熟crRNA和效应Cas蛋白形成的核糖核酸蛋白复合物，称为效应物或干扰复合物，识别并切割含有与crRNA间隔段互补序列的外来核酸片段。![]()
图1. CRISPR-Cas13适应性免疫的三个阶段:适应、表达和干扰
2. Cas13-VI型系统中crRNA成熟和识别的机制
在VI-A型、VI-B型和VI-D型中的crRNA识别已经有了非常详细的研究，以VI-A型系统为例，研究人员对LshCas13在未结合或结合靶RNA状态下的结构进行了剖析，如图2a所示，其中标记了LshCas13系统中Pre-crRNA裂解和靶RNA裂解的催化位点。Cas13蛋白将Repeat序列的茎环隐藏在REC叶的NTD结构域和螺旋-1结构域的间隙中（图2c-e）。crRNA的茎区主要通过与Cas13残基的骨架接触来识别，而环区则采用独特的构象，挤出二到四个核苷酸以序列特异性的方式识别。在目标RNA与crRNA间隔序列进行碱基配对之前，由于间隔片段的高度灵活性，在二元结构中有几个区域是不可见的。而在靶RNA结合crRNA后，REC叶与NUC叶发生结构域重排，生成RNA结合的间隙，Cas13a螺旋-2结构域在复合体形成时向NUC叶中的连接子结构域移动（图2e），如图，主要的结构域运动发生在螺旋-2结构域，它向连接体结构域移动。部分连接体结构域在crRNA结合状态下是无序的，用蓝色虚线圈表示，由此便形成了更紧凑的蛋白构象和crRNA活动通道。![]()
图2. LshCas13系统中crRNA成熟和识别的机制
3. Cas13-VI型系统中靶RNA识别的机制
研究人员继续对结合crRNA的LbuCas13a进行了剖析，并对添加互补靶RNA的状态进行了结构研究。如图3c所示，加入靶RNA后，Cas13a蛋白结构域的REC叶瓣与crRNA的重复序列结合，而NUC叶瓣形成了RNA双工结合通道，以容纳crRNA-靶RNA双工。值得注意的是，在靶RNA结合时，crRNA的重复序列的3 '侧翼发生了构象变化（图3d-g）。在装载靶RNA之前，与间隔序列连接的3’侧翼的三个核苷酸呈现预先排序的a型构象（图3d）。而在装载靶RNA之后，3’侧翼的这三个核苷酸向crRNA茎环移动并形成扭结（图3e-f）。同时，靶RNA诱导Cas13a的螺旋-2和HEPN-1蛋白组分也发生了构象变化（图3f-g），从而产生带正电荷的结合通道，以容纳crRNA-靶RNA双工（图3f），以及激活的复合HEPN催化袋，用于顺式和侧链反式RNA切割（图3g） 。![]()
图3. LbuCas13系统中靶RNA识别的机制
4. Cas13系统的RNase活性调控
研究表明，Cas13介导的免疫可以被其他因素调节，包括内源性辅助蛋白和噬菌体编码的Acrs基因。这些蛋白通过物理相互作用或与其他潜在信号通路的串扰来抑制或增强Cas13 RNase活性。如在VI-B1、VI-B2和VI-D系统上分别发现了编码Csx27、Csx28和WYL结构域蛋白的附属基因（图4a）。这些辅助蛋白在一级序列和结构域组织上没有相似性，表明VI型效应物的调节机制也存在差异。其中Csx27含有两到四个预测的跨膜螺旋结构域，在体内被证明可以抑制pbcas13b和bzcas13b的干扰活性，但其确切作用和抑制机制尚不清楚，通过对Csx27编码基因上下游邻近基因的生物信息学分析表明，Csx27可能形成膜通道，可能与泛素信号通路相关。而Csx28仅在VI-B2型系统中发现，预测模型中包含一个跨膜区域和一个发散的HEPN结构域。Csx28可能通过增强Cas13b的侧支活性来增加其干扰活性。最近的低温电镜结构研究显示PbCsx28以八聚体的形式存在，跨膜区域形成一个带正电的孔（图4c） 。预测的HEPN结构域采用非规范排列，呈现未知功能的新拓扑结构，与先前报道的结构没有相似性。值得注意的是，R-X4-6-H基序中预测的关键组氨酸和精氨酸残基彼此分开，指向相反的方向，不能形成催化能力强的复合核酸酶口袋（图4c中的放大框）。结合结构数据和功能分析，研究者提出Csx28会被Cas13b激活，导致Csx28的带正电孔形成和伴随的膜去极化。再者，含有WYL结构域的蛋白含有一个WYL结构域和一个螺旋-扭结-螺旋（或一个带状-螺旋-螺旋）DNA结合结构域。据报道，含有WYL结构域的蛋白通过转录抑制成为Cas13-Type I-D型系统的负调节因子，并被预测能够识别核酸或核苷酸衍生物。在Cas13-VI型系统中，RspWYL1在体外增加了RspCas13d及其直系菌EsCas13d的顺式和反式RNase活性，呈现出一种独特的转录非依赖性机制。生化和结构数据显示，RspWYL1由三个结构域（NTD、WYL和c -末端结构域（CTD））组成，并通过NTD - NTD和CTD - CTD结构域相互作用形成同二聚体（图4d） 。RspWYL1通过WYL和CTD结构域与ssRNA结合，但其对Cas13d的结合亲和力较弱。RspWYL1可能通过将更多的RNA定位到Cas13d催化口袋中和，或通过物理相互作用增强Cas13d活性，从而起到递送RNA的作用，但其确切的调节机制尚不清楚。此外，AcrVIA1是Cas13a的一种CRISPR抑制物，而AcrVIB1是Cas13b的CRISPR抑制物。在这些Acrs中，噬菌体编码的AcrVIA1与LseCas13a - crRNA二元复合物发生物理相互作用，从而降低RNase活性并消除Cas13a诱导的细胞休眠。对二元LseCas13a-crRNA和三元LseCas13a-crRNA-AcrVIA1复合物（图4e,f）的结构和生化分析表明，在三元复合物中，AcrVIA1位于Cas13a的crRNA暴露面，从而与Cas13a的NTD、螺旋-1、连接子和HEPN-1结构域以及间隔物的3 '段形成分子间接触。这些数据表明，AcrVIA1不仅阻止了靶RNA的进入和其与crRNA的碱基配对，而且还阻断了核酸酶激活所需的构象变化，从而使Cas13a保持在非活性状态。值得注意的是，单个病毒粒子递送的单剂量AcrVIA1完全拆除了Cas13-Type VI-A型CRISPR介导的免疫，这与DNA切割Cas核酸酶的抑制剂不同，后者仅引起有限的免疫抑制，需要多次感染才能绕过CRISPR防御。进一步的研究发现AcrVIA蛋白亚群普遍降低了Cas13a核酸酶活性，阻止了细菌和人类细胞中Cas13介导的RNA靶向和编辑，但这一结论仍然存在争议。![]()
图4. 内源性辅助蛋白参与Cas13-VI型系统的调控机制
5. 基于活性Cas13系统的生物技术应用
Cas13-VI型系统引起了极大的研究热度，因为Cas13-crRNA效应器是靶向切割ssRNA所必需的支架，在不进行遗传基因组编辑的情况下，在RNA水平上扩展了转录本的可编程操纵。从可编程RNA敲除到核酸检测，Cas13在生物技术领域中都有较大的应用范围。如Cas13a、Cas13b、Cas13bt和Cas13d已被用于原核和真核细胞以及动物模型中的可编程RNA敲除。其中，Cas13d和Cas13bt的大小比Cas13a和Cas13c更紧凑，这在腺相关病毒（AAV）介导的递送中提供了潜在的优势。在核酸检测领域，通过荧光标记RNA监测Cas13侧链反切活性，促进了分子诊断中快速、敏感和特异性核酸检测的新兴技术的发展。通常情况下，核酸样本被扩增，然后进行转录，从而产生ssRNA靶标（图5a）。当ssRNA靶碱基与crRNA间隔序列配对时，Cas13被激活并反式切割荧光团猝灭的ssRNA报告基因以释放荧光信号（图5b）。又如等温扩增方法需要比传统PCR扩增更低的温度，已被整合到基于Cas13的模板扩增检测应用中（图5a）。这种策略如特异性高灵敏度酶报告基因解锁（SHERLOCK），提供了在原子摩尔水平（~6.5 copies/μl）的检测限（LOD），与逆转录定量PCR （qRT-PCR）相当，并且在临床研究中被证明是可靠的。同时，SHERLOCK使用Cas13和Cas12a同源物进行多路复用，可以在一个样本中多路检测四个目标序列。![]()
图5. 基于Cas13的RNA靶向技术
6. 基于失活Cas13系统的生物技术应用
催化失活Cas13 （dCas13）可以作为可编程RNA结合平台，改变RNA的特性，从而影响碱基编辑、修饰编辑和剪接调节，或研究RNA的定位和其与伴侣蛋白的相互作用。基于位点特异性RNA的编辑依赖于dCas13融合脱氨酶（图6a）。通过在编辑位点产生单个错配，被翻转的核苷酸可以被脱氨酶捕获。第一个版本的RNA碱基编辑器是通过将dCas13b与脱氨酶ADAR2（作用于RNA II型的腺苷脱氨酶）融合而开发的，称为REPAIR， 产生的肌苷在翻译和剪接反应中模仿鸟苷，可以实现腺苷到鸟苷的交换。同时，dCas13已应用于多种策略的可编程控制的选择性拼接，通过与目标pre-mRNA的剪接元件结合，dCas13可以单独改变剪接并诱导外显子敲除。但考虑到这种方法不能诱导外显子接合，用CasRx替换剪接因子的RNA识别基序，可以对选择性剪接进行可编程控制 （图6b），当与化学诱导的FKBP （FK506结合蛋白）-FRB （FKBP -雷帕霉素结合）结构域偶联时，CASFx受到小分子的控制，允许对选择性剪接进行控制。此外，N6 -甲基腺苷（m6A）修饰的形成、去除和功能受到一系列蛋白的调控:甲基转移酶复合物METTL3-METTL14及相关蛋白、去甲基化酶FTO、ALKBH5、读取器YTHDF1-YTHDF3。dCas13可以作为可编程RNA-m6A修饰编辑的适配器，通过与不同的蛋白质融合，可以研究m6A修饰在活细胞中对单个转录本的功能作用（图6c）。![]()
图6. 基于dCas13的RNA操作技术
（1）CRISPR-Cas13系统具有多样性和复杂性，其体内免疫过程分为三个阶段:适应、表达和干扰，是原核生物在频繁的病毒攻击或入侵的移动遗传元件中生存的策略；（2）Cas13系统中crRNA和靶RNA的侵入都会导致Cas13的实质性构象发生变化，通过多个结构域的构象重组呈现活性的顺式和反式核酸切割口袋，发挥其RNase活性；（3）Cas13介导的免疫还可以被其他因素调节，包括内源性辅助蛋白和噬菌体编码基因。这些蛋白通过物理相互作用或与其他潜在信号通路的互相干扰来调控其RNase活性；（4）CRISPR-Cas13系统由于其可编程的RNA识别和切割能力，提供了强大的RNA靶向、编辑、检测和成像平台，具有新兴的生物技术和治疗应用。
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[1] Structures,
mechanisms and applications of RNA-centric CRISPR–Cas13. Nature Chemical Biology, 2024, 20, 673-688.
