用于临床诊断的高效CRISPR/Cas电化学协同剪切平台
文摘
科学
2024-10-25 10:24
浙江
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CRISPR Cas12a的高准确性分子识别能力及反式切割活性奠定了其在生物传感领域的地位，为精确诊断疾病带来了新的机遇，已出现了多种应用不同类型的Cas蛋白、报告分子、读出技术的基于CRISPR/Cas的核酸检测平台。但由于核酸的聚阴离子性质，其结构受到静电力的强烈影响；且核酸的单体结构单元之间的强相互作用使其难以形成特定序列的特定结构。因此，长靶标序列在溶液中的结构倾向于堆叠，并且大部分的结合位点被覆盖。在传统的CRISPR/Cas电化学检测中，可利用的结合位点数量有限，使得检测限难以达到fM级别，需要较长的孵育时间和预处理过程，进一步提高检测性能难度较大。故而，亟需一种能够克服现有CRISPR/Cas系统的局限性的方法。基于此，复旦大学的刘云圻院士团队构建了一个CRISPR/Cas协同剪切系统（CRIPSR-CS）。该系统中两个CRISPR/Cas-crRNA复合体存在两个识别位点，克服了低结合效率，并偶联电化学检测实现在无扩增条件下灵敏检测痕量病原体。相关成果以“An Efficient
CRISPR/Cas Cooperative Shearing Platform for Clinical Diagnostics Applications”为题发表在Angewandte Chemie International Edition（DOI:10.1002/anie.202411705）。1. CRISPR-CS的工作原理
CRISPR-CS系统利用两个不同的crRNA，使得Cas12a-crRNA复合体能够有效结合靶DNA上的两个不同位点，形成独立的三核螺旋复合物以激活Cas12a的酶切活性（图1a）。在传统的CRISPR系统中，若靶向位点被覆盖，Cas12a-crRNA复合体将无法与靶标结合，而CRISPR-CS系统拥有另一个可用的靶向位点，Cas12a-crRNA复合体仍具有很高的识别概率，将显著提高Cas12a与靶标DNA的结合、捕获效率及剪切效率。工作电极的表面覆盖有石墨烯膜，修饰有亚甲基蓝基团（MB）的DNA四面体纳米结构（TDN-MB）通过1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯（PASE）与石墨烯膜偶联。当施加负电位时，由于DNA骨架带负电，TDN-MB在溶液中保持直立，悬臂末端的MB远离电极。而当靶标存在时，两个Cas12a-crRNA复合物结合靶DNA上的两个位点，Cas12a被激活，切割TDN-MB上的单链悬臂，将MB分子推离电极，导致最初的高电信号显著降低（图1b）。![]()
图1 CRISPR-CS的工作原理
2. CRISPR-CS系统协同剪切性能验证
为了检验CRISPR-CS系统的可行性，研究团队选择了人畜共患病原体—猴痘病毒（Mpox）作为靶标。他们分别设计了两个crRNA以靶向Mpox病毒的B6R位点和F3L位点，并采用差示脉冲伏安法（DPV）对信号进行了分析。随着靶标浓度从10−19 M增加到10−15 M，峰值电流逐渐减小(图2a)。当靶标浓度大于10−14M时，电流响应趋于稳定，响应值约占初始电信号的0.62%(图2b)，计算得出LoD为9.5´10−20M。研究团队同时设计了仅靶向B6R位点或F3L位点、Cas12a-crRNA复合体添加量为双倍的Double-F3L、Double-B6R作为对照组，CRISPR-CS系统具有更宽的检测范围及更显著的信号变化（图2b）。等离子体共振实验（SPR）结果表明CRISPR-CS系统的平衡解离常数比另外两组低一个数量级，证明其确实具有更强的结合亲和力。研究团队还测试了CRISPR-CS及对照组在添加浓度为10−17 M的靶标后不同时间的ΔI/I0响应（图2c）。CRISPR-CS系统在5 min内产生显著的电流响应，而Double-F3L和Double-B6R实现类似的响应大约需要12 min。故CRISPR-CS系统的协同剪切效应不仅提高了检测灵敏度，还加快了反应速度。且CRISPR-CS在Mpox核酸检测中表现出良好的特异性（图2d）及重复性（图2f）。与现有其他方法相比，CRISPR-CS系统在检测时间和LoD方面表现优异（图2e）。![]()
图2 CRISPR-CS的性能验证及与其他系统的比较
3. 报告分子的结构优化
研究团队利用荧光染料Cy3取代TDN悬臂上的MB，证实了CRISPR-CS系统的协同剪切效应增强了Cas12a对TDN悬臂的剪切效率。在靶标浓度为10-16 M时，CRISPR-CS系统在4 min内产生了显著的荧光猝灭，而Double-F3L和DoubleB6R系统需要约10 min完成（图3a）。由于报告基因的结构对CRISPR-CS系统的信号转导至关重要。研究团队设计了5种不同结构的TDN-MB报告基因，包括17 bp-10、17 bp-20、17 bp-30、7 bp-20和37 bp-20。框架过小会导致难以避免相邻悬臂的纠缠，而过大则会影响TDN-MB的信号传输。因此，17 bp-20的四面体结构，框架高度接近于悬臂长度，比其他高度过高或过低的悬臂更可控，且更接近石墨烯表面。在加入10−16 M 靶标后，具有17 bp-20结构的TDN-MB产生显著的信号响应，至少为其他四种结构的1.3倍（图3b）。此外，石墨烯的引入显著增强了TDN-MB的初始信号，使CRISPR-CS系统在检测相同浓度的靶标时能够产生更强的ΔI/I0响应（图3c）。为验证CRISPR-CS系统的多功能性，研究团队将其应用于检测人乳头瘤病毒（HPV）及肌萎缩侧索硬化症（ALS），LoD分别为1´10-18 M及1´10-17 M，且均展现出了良好的线性范围，证实了CRISPR-CS系统的高通用性。![]()
图3 CRISPR-CS的性能测试
4. 临床样本测试
CRISPR-CS系统通过无扩增检测大大缩短测试步骤和时间（图4a）。研究团队检测了36例HPV临床标本，其中16例为阳性（P1~P16），20例为阴性（N1~N20），CRISPR-CS的灵敏度为97.9%，特异性为98.3%（图4c、4d）。当检测梯度稀释后的阳性样本P5时，信号变化随着样品稀释倍数的增加而减小（图4b），上述结果表明CRISPR-CS平台可用于疾病靶序列的准确核酸检测。为了构建更有效的广义疾病检测平台模型，研究团队选择了支持向量机（SVM）为机器学习算法，通过线性核函数进行训练后，准确率达97.14%，能够有效区分阴性和阳性样品（图4e）。![]()
图4 使用CRISPR-CS系统进行临床样本检测
1. 研究团队设计了一种CRISPR-CS系统，克服了由靶标序列折叠引起的剪切效率下降。该平台实现了迄今为止最灵敏的电化学核酸检测，且为无扩增，并与临床PCR结果高度一致；2. 除核酸检测之外，CRISPR-CS系统还具有许多潜在应用：将CRISPR-CS递送至特定的细胞、组织或器官，进行有效的基因编辑；将CRISPR-CS用于体内染色体成像可减少背景信号。注：该文为最新科研动态新闻报道，如与原文作者有原创冲突，可与本公众号作者联系删除。
[1] An Efficient CRISPR/Cas Cooperative Shearing Platform for Clinical
Diagnostics Applications. Angewandte Chemie International Edition, 2024,
DOI: 10.1002/anie.202411705.
