分裂型DNA activator对Cas12a反式切割活性的影响
文摘
科学
2024-10-11 11:11
浙江
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CRISPR-Cas12a是一种RNA引导的核酸酶，该酶具有对靶标DNA的顺式切割能力和对非靶标单链DNA
(ssDNA)的反式切割能力，已被用于基因编辑和分子诊断领域。DNA激活剂的结构可以影响Cas12a的反式切割活性。研究表明，两个分裂的ssDNA激活剂不能单独激活Cas12a的切割活性，但当它们共存时，Cas12a则表现出很强的反式切割活性。分裂的ds
DNA激活剂似乎也具有类似的协同作用，但相关研究较少，仍需要进一步探索。温州医科大学楼永良和郑来宝课题组证实分裂型DNA激活剂协同作用可激活Cas12a的反式切割活性，并深入了探究这一现象背后的原因，提出两个关键概念——外显子解旋和诱导靶向效应。相关成果以“Synergistic
effect of split DNA activators of Cas12a with exon-unwinding and induced
targeting effect”为题发表在国际权威杂志Nucleic Acids Research上。为考察异形结构DNA激活剂对Cas12a反式切割活性的影响，作者设计了在不同位置具有凸起结构或缺口结构的DNA激活剂，并通过体外反式切割分析评估了这些结构的影响(图1)。研究结果表明，Cas12a反式切割活性对具有异形结构的TS特别敏感，活性抑制效果取决于异形结构的位置。相比之下，该活性对NTS内的异形结构则表现出更强的耐受性。此外，Cas12a反式切割活性对凸起结构的敏感性强于缺口结构，特别是当凸起结构出现在TS中部时，反式切割活性几乎完全被抑制。作者还构建了在TS和NTS上同时具有凸起结构和缺口结构的DNA激活剂，并对其进行了体外反式切割分析，结果进一步证明dsDNA能否启动反式切割活性主要受TS控制，NTS也有部分影响。TS对反式切割活性的影响可能是由其与crRNA结合的吉布斯自由能决定的，而NTS对反式切割活性的影响可能是其影响蛋白变构而导致的。![]()
图1 具有异形结构的DNA激活剂对Cas12a的反式切割活性的影响
上述结果证明分裂的dsDNA激活剂似乎对Cas12a反式切割活性激活具有协同效应。为了阐明这种协同效应背后的机制，作者首先验证了较短的dsDNA (≤13 bp )不能单独启动Cas12a的反式切割活性(图2A-B)。考虑到协同作用的潜力源于靶标浓度的增加，作者将用于反式切割分析的分裂dsDNA激活剂的浓度提高一倍，然而荧光强度并没有显著增加，结果表明分裂的dsDNA激活剂对Cas12a反式切割活性的激活是单个Cas12a-RNP复合物中两个分裂的dsDNA激活剂结合的结果。先前的研究表明，Pp-ds17可以独立激活Cas12a。在该研究中，作者观察到一致的结果。然而，没有PAM的Pd-ds17也激活了Cas12a的反式切割活性。作者将其归因于可能导致部分链置换和单链激活的DNA呼吸效应。为了缓解这种情况，作者在后续的研究中延伸了Pd-dsDNA NTS的5’端以增强双链稳定性，减少DNA呼吸。为探索Cas12a-RNP内两个分裂的dsDNA激活剂的组装过程，作者初步假设了一个基于随机扩散的组装过程。若通过随机扩散，预期在100 nM Cas12a-RNP和1 nM分裂型ds DNA激活剂存在的情况下，组装的dsDNA激活剂最多为10 pM。然而，10 pM的完整dsDNA激活剂不能启动反式切割活性，而分裂dsDNA激活剂可以启动该反应，说明分裂的dsDNA激活剂在Cas12a-RNP中并不是随机组装的(图2D )。为了更直观地说明这一点，作者进行了荧光共振能量转移( FRET )实验。作者分别用FAM和BHQ1标记分裂型DNA激活剂的末端，当分裂的dsDNA聚集在一起时即可发生荧光猝灭。实验现象表明，猝灭只发生在Cas12a存在的情况下。根据标准曲线，当分裂的dsDNA激活剂浓度为10 nM时，约有20 %的dsDNA激活剂发生猝灭(图2E-G)。另外，只有当Cas12a与crRNA共存时，才具有诱导靶向作用。同样的情况也发生在FnCas12a和AsCas12a中。基于这些发现，作者提出了诱导靶向效应假设：Pp-dsDNA最初被Cas12a通过PAM识别并捕获，部分激活Cas12a-RNP。这种部分活化使配合物具有随后捕获Pd-dsDNA的能力，然后将两者结合起来共同启动反式切割活性。![]()
图2 分裂的dsDNA激活剂通过诱导靶向效应增强Cas12a的反式切割活性
接着，作者对ssDNA激活剂所具有的类似作用的原理进行研究(图3)。结果表明，分裂型ssDNA激活剂对Cas12a的激活作用不是由目标浓度的增加或随机扩散过程引起的。通过FRET分析，作者观察到单独crRNA存在时，实验组荧光强度无明显变化，而当Cas12a和crRNA共存时则可观察到荧光猝灭，这意味着激活剂的组装。上述实验表明Cas12a和crRNA共同参与了诱导靶向过程。![]()
图3 分裂ssDNA激活剂诱导靶向作用
随后，作者研究了ssDNA和dsDNA激活剂联合使用是否也会表现出协同作用(图4)。作者对两种不同的DNA组合进行了体外反式切割分析：Pp-ssDNA与Pd-dsDNA配对以及Pp-dsDNA与Pd-ssDNA配对。结果表明，ssDNA-dsDNA结合确实增强了协同作用。然而，Pp-ss3与Pd-ds17 ( NTS-5’端悬垂)的组合并没有表现出协同作用，可能是由于Pp-ss3的长度较短且没有PAM序列的辅助，使其不能有效地与Cas12a-RNP结合，从而不能介导Cas12a-RNP捕获Pd-ds17。通过FRET，观察到Pp-ssDNA与Pd-dsDNA或Pp-dsDNA与Pd-ssDNA的结合能够在Cas12a-RNP存在时诱导靶向效应。为了排除干扰，作者设计了一个与crRNA不互补的ssDNA作为Pp-DNA进行上述实验。结果表明，若Pp-DNA与crRNA不互补就不能启动诱导靶向作用。综上，作者完善了关于诱导靶向效应的假设：当Pp-DNA激活剂与Cas12a-RNP有效结合后，部分激活Cas12a-RNP复合物。这种部分激活使配合物具有与Pd-DNA激活剂结合的能力，从而导致Pp-DNA与Pd-DNA的同时结合并共同启动Cas12a的反式切割活性。![]()
图4 分裂ssDNA和dsDNA激活剂的协同作用
上述实验中，Pd-dsDNA片段缺乏对其解旋和随后与crRNA结合必不可少的PAM位点，这意味着Pd-dsDNA需要Pp-DNA激活剂的促进。为探究这一点，作者对Pd-dsDNA的序列进行延伸，并进行了反式切割分析(图5A-C)。在Pp-DNA的辅助下，Pd-dsDNA的双链会发生解旋。然而，这种解旋活性只有当TS的识别区域位于末端时才能发生，否则可能由于空间位阻而无法实现。因此，作者将该效应称为外显子解旋。随后，作者通过进一步实验证明了PAM对于Pp-dsDNA的重要性。当Pp-dsDNA中无PAM位点时，协同效应会大幅减弱。当Pd-DNA以ssDNA形式存在时，表面上能够与Cas12a-RNP结合，但PAM序列的缺失导致Pp-dsDNA不能解旋，故没有明显的荧光信号(图5D-E)。上述结果表明，Pp-DNA在启动外显子解旋效应中发挥重要作用，PAM在介导分裂DNA激活剂协同效应中不可或缺。为了进一步了解外显子的解旋过程，作者在Pd-DNA末端的连接处引入了FAM和TAMRA修饰。通常情况下，由于这些修饰基团距离较近，荧光会发生淬灭。然而，当双链解旋后，可观察到荧光恢复，其强度随着修饰基团之间距离的增加而增加(图5F)。因此，可以通过荧光的恢复来推断外显子解旋的发生。结果表明，荧光恢复仅取决于Pp-DNA的存在，而不管它是以双链还是单链形式存在(图5G)。因此，作者推断Pd-dsDNA的解旋是由Pp-DNA促进的。![]()
图5 分裂dsDNA激活剂外显子解旋效应
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图6 具有诱导靶向效应和外显子解旋效应的分裂dsDNA激活剂的协同作用
温州医科大学楼永良和郑来宝团队证实分裂型DNA激活剂对Cas12a的反式切割活性具有协同作用。作者深入探究了这一现象背后的原因并提出两个关键的概念——外显子解旋和诱导靶向效应。对于Pp-DNA激活剂，ssDNA可以直接与Cas12a-RNP复合物结合，而dsDNA则需要PAM的协助才能有效结合。在与Pp-DNA有效结合后，Cas12a获得诱导靶向和外显子解旋的能力，使其能够再结合并解旋Pd-dsDNA(图6)。作者认为分裂DNA激活剂对Cas12a的激活作用可能与Cas12a的变构有关。Cas12a的反式切割活性取决于与crRNA和DNA激活剂的相互作用，它们共同促进Cas12a的变构。单个分裂的DNA激活剂似乎不足以在Cas12a中诱导完全的变构，导致只有部分的构象变化。这种部分变构赋予Cas12a寻找并结合互补链的能力，从而完成变构。总之，该项研究为理解分裂型DNA激活剂对Cas12a的激活作用提供了一个理论框架，为潜在的应用提供理论支持。注：该文为最新科研动态新闻报道，如与原文作者有原创冲突，可与本公众号作者联系删除。
[1] Synergistic effect of split DNA activators of
Cas12a with exon-unwinding and induced targeting effect. Nucleic Acids Research,
2024, DOI: 10.1093/nar/gkae766.
