常温Ago联用基于深度学习的多分散液滴生物传感器构建免扩增多重核酸检测平台
文摘
科学
2024-06-28 10:15
浙江
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来自华中农业大学食品科学技术学院的团队在《Analytical Chemistry》上发表了题为Mesophilic
Argonaute-Mediated Polydisperse Droplet Biosensor for Amplification-Free,
One-Pot, and Multiplexed Nucleic Acid Detection Using Deep Learning的研究论文。通讯作者陈翊平教授的研究方向是纳米生物传感器在食品安全，临床诊断等领域的应用研究，微流控芯片在食品安全、临床诊断和环境监测中的应用研究以及食品加工过程中有害物质的消除、控制和有益成分的保留和增强PAM位点的依赖、向导RNA的不稳定和Cas蛋白非特异的切割活性阻碍了基于CRISPR的核酸检测的进一步推广和应用。原核Ago（pAgos）可以通过碱基配对，利用5’-磷酸化或5’-羟基化向导DNA（gDNA），切割互补的DNA（tDNA）核酸靶标。然而大部分被用于检测的pAgos工作温度均超过75 ℃，高温处理使整个操作过程复杂。目前基于pAgos核酸检测平台大多依赖扩增技术以实现较好的灵敏度，这使得周转时间被拉长。为解决上述问题，作者提出了一种CbAgo介导的、深度学习驱动的可编程、无扩增系统（PASS），用于在一锅常温下快速进行核酸定量。在多分散液滴中，CbAgo特异性识别致病菌的DNA，切割探针产生相应的荧光信号。接着，作者构建了一种基于深度学习的计算机视觉软件，将图像转换为数字信号，克服了由于液滴不均匀导致的微反应单元识别困难，并成功地对三种食源性病原体进行了定量分析。作者使用大肠杆菌表达和纯化了CbAgo蛋白并测试其gDNA引导的内切酶特性。在37 ℃下，CbAgo可以使用长度范围为16~21 nt的gDNA切割ssDNA靶标，切割效率在30 min后达到稳定状态。此外，作者对CbAgo在相同体系中，切割一轮tDNA和切割两轮tDNA的效率做了考察，发现在两轮切割反应中，CbAgo都表现出了对底物DNA的快速和稳健的裂解效率。![]()
接着对利用乳化剂生成液滴的均一性和稳定性进行了表征，发现乳化剂使用量为10 μL时（水相W/油相O=20:200 μL），形成的乳剂相对更均匀，且在85℃保存48 h后更稳定。通过激光扫描共聚焦显微镜和荧光染料以确认W/O乳剂的形成，在乳剂内部可以识别出不同的荧光信号。由于微液滴的约束效应，小液滴的荧光信号比大液滴强，意味着微小液滴中的荧光信号足够集中，而较大的液滴则更加分散。![]()
随着系统中荧光团标记的ssDNA浓度的增加，在共聚焦荧光显微镜下获得的荧光图像中明亮区域的比例也显著增加。作者通过二值化的阈值选择，将图像的灰度值转换为0和255，即非黑即白。黑色（0）为背景（暗域），白色（255）为前景，即目标区域（亮域）。所有大于阈值的像素被转换为255，所有小于阈值的像素被转换为0，从而简化程序的统计流程。为了能够灵敏地检出病原微生物，作者选择了三个阈值进行优化（2、4和6），发现在所有检测浓度下，只有单核增生李斯特菌的图像在所有三个阈值下都显示出可量化的信号，而金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门菌只在两个阈值下(4和6)可被检出。单核增生李斯特菌和鼠伤寒沙门菌的信噪比在阈值设置为4时效果最好，而金黄色葡萄球菌则在4和6阈值时更好，因此选择4作为本方法的最优阈值。此外，由于W/O微滴的形成，大多数亮区都有一个特定的圆形边界，其大小与微滴的大小一致。为了识别液滴的便捷，作者利用深度学习技术，进行了灰度转换、二值化和更快的基于区域卷积神经网络（RCNN）的区域检测来处理图像，以便进行后续的统计分析。![]()
在优化后的参数下，PASS在较宽的浓度范围内成功检测了三种食源性病原体，并使用定制的深度学习对不同体积液滴的荧光强度进行了校正。对获得的照片进行处理后，荧光强度与三种细菌的浓度呈良好的线性关系（R2> 0.99），单核增生李斯特菌的检测范围为103~108 CFU/mL，鼠伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌的检测范围为102 ~108 CFU/mL。![]()
以金标准qPCR进一步验证，PASS能够实现与qPCR相似的检测范围，金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门菌的检测灵敏度与qPCR相同，单核增生李斯特菌的检测水平略低于qPCR。数字液滴PCR (digital
droplet PCR，ddPCR)与PASS方法相似，但对上述病原微生物的检测线性范围在102 ~ 106 CFU/mL之间，略窄于PASS。但与ddPCR相比，PASS不需要昂贵的微液滴生成设备，具有成本低、操作方便、分析时间短等优点。在没有液滴生成系统的情况下，即使细菌浓度高达108 CFU/mL，在孔板中仍不能检测到荧光信号，说明PASS对食源性病原体DNA的检测是敏感的。![]()
CbAgo的特异性和抗干扰性主要取决于gDNA与tDNA的特异性结合。在多至三种混菌体系条件下，PASS均成功检出体系中存在致病菌。在对常见的五种食源性病原体(单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和副溶血性弧菌)的检测中，特定的靶标gDNA只能引导CbAgo切割特定的tDNA，不会由于交叉反应而引发其他荧光通道的信号变化。![]()
随后，作者考察了基于CbAgo的PASS方法在多重检测中的潜力。PASS对多重检测的灵敏度与单重检测相似，保持了对三种细菌灵敏的检出能力，荧光图像显示荧光强度与浓度具有良好的相关性。金黄色葡萄球菌的检测线性范围为102~105 CFU/mL，单核增生李斯特菌为103~106 CFU/mL，鼠伤寒沙门菌为102~106 CFU/mL。三种病原体的检出限分别为2、3和5 CFU/mL。此外，在利用该方法对30个鸡蛋样本进行的致病菌的评估中，PASS和qPCR对三种病原菌的检测结果相同。相关性分析表明，两种方法的一致性较高，相关系数大于0.95。结果表明，该方法检测食源性致病菌的准确度较高，即使在复杂的样品中也有很好的检测效果，且PASS的反应时间比qPCR短。为了检验该方法的普遍性，作者将其应用于临床诊断耐药菌，特别是不同浓度的克雷伯氏菌NDM-1、鲍曼不动杆菌OXA-23和铜绿假单胞菌Oprd。结果显示，三种耐药菌的荧光强度在101 ~ 108 CFU/mL范围内具有良好的相关性和显著的差异，说明PASS方法不仅限于食源性病原体检测，而且在临床诊断等其他关键领域也有潜在的应用前景。![]()
优势：
1. PASS引入液滴，不需扩增步骤，且液滴生成方式简单。
2. PASS均相反应不涉及液体转移。
3. PASS检测时间短于qPCR，准确度与qPCR一致。
4. PASS引入深度学习，克服了量化大小不一的液滴荧光强度的困难。
不足：
1. 虽然不需要加热和液滴生成设备，但仍需要显微镜等大型成像设备进行读取。
2. 常温Ago的切割动力学较差，导致信背比不如Cas系统。
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[1] Mesophilic Argonaute-Mediated Polydisperse Droplet
Biosensor for Amplification-Free, One-Pot, and Multiplexed Nucleic Acid
Detection Using Deep Learning. Analytical Chemistry, 2024, 96, 5, 2068–2077.
