由核酸激活的短pAgo STARTA防御机制
文摘
科学
2024-08-30 10:23
浙江
![]()
自CRISPR-Cas系统作为保护原核细胞免受噬菌体侵害的免疫系统被发现而后被广泛开发应用于基因编辑功能以来，新的细菌防御系统一直是众多科研工作者的研究热点。近期，在细菌中发现一种不同于长pAgos和真核Agos防御系统的短原核Argonaute（pAgo） TIR-APAZ（SPARTA）防御系统，目前还没有较为清晰的解析SPARTA防御机制。因此，为了进一步揭示SPARTA防御机制进而开发短pAgo功能，来自西奈山伊坎医学院的Jithesh Kottur团队利用结晶和冷冻电镜技术分别比较了Apo（未结合核酸的） SPARTA以及gRNA/tDNA（靶标ssDNA）结合SPARTA的结构，发现SPARTA除具有APAZ结构域外（相当于长pAgo的N、L1和L2区域）,SPARTA还拥有特殊的MID结构域（内含insert57区域），当外源DNA入侵时，APAZ以及PIWI会重塑与核酸的结合口袋进一步让TIR结构域发挥NAD（P）水解功能消耗NAD（P）进而杀死感染细胞，相关成果于2024年发表在Nature Communications期刊上，题名为《Nucleic acid mediated activation of a short prokaryotic Argonaute immune
system》。作者首先共表达和纯化来自于Crenotalea
thermophila的异二聚体TIR-APAZ/短原核pAgo复合物SPARTA，如图1a、b。随后利用质量光度法表征gRNA/tDNA存在与缺失状态下的状态，通过表征发现，Apo SPARTA是以异二聚体形式存在，其分子量为109KDa左右。与gRNA/tDNA结合后，其存在形式主要为异二聚体的单体、二聚体和四聚体（如图1c），且通过AlphaFold模型重构SPARTA异二聚体的四聚体结构（以下简称SPARTA寡聚物），其中TIR（1-138残基）和APAZ（161-420）通过linker（139-160）连接，面向MID（1-269残基）和PIWI（270-507残基）结构域，TIR结构域只与MID结构域接触，APAZ主要与PIWI结构域接触，如图1d，这也是短pAgo与TIR-APAZ按照化学计量比1：1形成的Apo SPARTA失活的结构。![]()
图 1. Apo SPARTA的整体结构
SPARTA与人hTLR2、人hSARM1、植物NLR-RPP1、细菌TIR-SAVED拥有类似的由被helices和loops包围β-sheet组成的TIR结构域。据研究表明，SPARTA的APAZ结构域通常与短pAgo相关且 APAZ与长pAgos的N和L1区域同源，因此作者通过建模将APAZ结构域分为三个区域分别为APAZ-N（167-280残基）、APAZ-L1（281-352残基）和APAZ-L2（353-450残基），在长期的选择进化过程中，APAZ虽然失去了与长pAgos相关的PAZ结构域但是仍保留了对应于N、L1和L2的区域，并通过与TIR、SIR2或核酸酶等酶结构域融合而获得新功能，如图1f所示。作者进一步发现SPARTA的MID结构域与长CbAgo类似，比较特别的是SPARTA的MID包含了一个特殊的insert57结构域，该结构域只在短pAgos中高度保守，且其存在于α-5和α-7之间，由一个长的α-6和两个短螺旋组成，从MID结构域主体向外延伸，如图1g所示。同样的，作者发现SPARTA的PIWI结构域与长CbAgo类似，但是又与大多数的长pAgo不同，短pAgo的PIWI结构域由于缺乏用于水解DNA或RNA的酸性残基所以不具催化活性，同时作者将SPARTA和CbAgo的MID和PIWI结构域叠加发现，APAZ结构域占据了CbAgo的N、L1和L2区域，这进一步证实一个观点，短pAgo防御系统可能是由长pAgo产生的，在长期选择性进化过程中虽然失去了PAZ结构域但获得了融合TIR、SIR2或核酸酶获得其他功能的能力，如图1g。Apo状态下的SPARTA结构解析了SPARTA的失活机制，通过冷冻电镜作者观察到当gRNA/tDNA存在时，由A、B、C、D异二聚体组成类似于蝴蝶状的SPARTA寡聚体形态，如图2a、b所示。该寡聚物外部有MID、PIWI和APAZ结构域（蝴蝶翅膀），内部有TIR结构域（蝴蝶身体），且有趣的是，作者发现TIR的组装类似于支架蛋白Myd88和MAL的平行链排列，而不是像酶蛋白SARM1和RPP1中的反平行链排列，不过最近也在AbTir中发现TIR结构域是通过平行链排列组装的，如图2c。![]()
图 2.
SPARTA四聚体结构
单个SPARTA异二聚体通过其MID、PIWI和APAZ结构域结合单个gRNA/tDNA双链体，如图2a、b和3所示。gRNA/tDNA双链体被包裹在MID-PIWI和APAZ结构域间的通道中，其主要靠MID结构域的Arg72、His207、Lys211等残基和PIWI、APAZ的Ser288、Arg201、Lys328等残基形成氢键或静电相互作用去结合核酸，概括之即APAZ结构域在促进核酸链结合方面实现了类似于长pAgos的N、L1和L2区域的功能，如图3所示。![]()
图 3.SPARTA结合gRNA/tDNA结构示意图
此外，作者通过将Apo SPARTA异二聚体结构和寡聚物中的异二聚体结构进行叠加，发现两个关键片段其构象发生显著变化，正是这两个片段的构象改变促进了gRNA/tDNA结合。第一个是PIWI结构域中的Loop10-9（319-331残基），在与核酸结合时，Loop10-9（323-331）进入核酸结合通道并缩短4个残基以便gRNA/tDNA双链体结合，如图4a、b，更有趣的是Loop10-9这种构象变化会传递至相邻蛋白片段，使链β9失去二级结构趋向于形成环状结构且与Asp306和Asp309残基重塑PIWI结构域的核酸结合口袋便于核酸结合，如图4a-c所示。另一个重要片段为APAZ-L2的C末端helices（αN）（图1f和图4a），在核酸结合Apo STARTA时，此αN向远离tDNA方向运动以便结合口袋结合tDNA。言而总之，Loop10-9和αN似乎是Apo STARTA维持自动抑制状态的关键元件。![]()
图 4.SPARTA结合核酸后的构象变化
此外，作者在叠加Apo以及核酸结合的STARTA结构过程中偶然发现TIR结构域的不对称构象变化，研究表明在TIRs自组装过程中活性位点会横跨两个subunits结合和水解NAD+。图5A展示的是在TIR发生作用时的活性位点就在所涉及的TIRA或TIRC的部分残基、TIRB或TIRD的BB-Loop的部分残基所形成的BE界面，为了探究BE界面的重要性作者选择对在TIR序列中保守的活性位点进行定点突变，突变后进行活性测试发现突变之后活性不同程度的丧失如图5b所示，此外在AbTir以及SARM1中均发现类似于BE界面的存在（图5c），由此说明BE界面在整个SPARTA防御机制中起着重要作用。![]()
图 5.TIR结构域活性位点分析
作者在实验过程中发现SPARTA寡聚物的形成是大量的pAgos异二聚体之间通过蛋白与蛋白间的相互作用力形成二聚体，然后通过TIR结构域形成异二聚体的四聚体也就是最终具有催化活性的SPARTA寡聚物。 了解寡聚物形成之后，作者通过探究发现Loop10-9在删除四个残基后SPARTA失去了形成二聚体的能力，导致NADase活性完全丧失，由此初步认定Loop10-9在SPARTA在与核酸结合和形成寡聚物过程中同样起着十分重要的作用。
本文工作结合晶体学以及冷冻电镜技术将SPARTA结合gRNA/tDNA前后的过程可视化，深入挖掘SPARTA的失活和催化机制，从结构学角度分析SPARTA防御外源DNA入侵的整个过程。比较有趣的是通过观测SPARTA晶体结构发现其MID结构域中具有非常特殊的insert57，它是不存在于长pAgo，存在于短pAgo中且序列相对保守的一段片段，虽然目前暂未发现insert57的功能，但是其序列相对保守有值得探究的地方。总之，该篇工作深入解析了新的基于短pAgo的SPARTA防御机制，目前科学研究中除Cas系列蛋白外发挥强大编辑功能的较多的是长pAgos，该篇文章为进一步挖掘具有强大编辑功能的短pAgo奠定一定基础。
注：该文为最新科研动态新闻报道，如与原文作者有原创冲突，可与本公众号作者联系删除。
[1] Nucleic acid mediated
activation of a short prokaryotic Argonaute immune system. Nat. Commun., 2024, 15, 4852.
