一种用于无电源快速检测致病菌的一体化滑动芯片
文摘
科学
2024-10-04 11:09
浙江
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据世界卫生组织统计，70%的食源性疾病都能追溯到相关的致病菌，如沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌等。这些病原体的即时检测（POCT）对于预防和控制食物中毒变得越来越重要。微流控芯片具有体积小、操作自动化、便携性好等特点，常与生物传感器结合使用，成为病原体POCT的潜在方案。目前，许多微流控芯片依赖于精确控制的泵或需要外部电力的阀门来自动或半自动地操作流体，这极大地限制了它们的实际应用。微流控滑动芯片（SlipChip）无需电源驱动，自开发以来便受到了广泛关注，能够在芯片内集成多步复杂操作，从而提高反应效率。此外，不对称分离-再组合（ASAR）微混合器能在较大的流速范围内表现出优异的混合效率，常常与SlipChip结合使用。为了提高生物传感器的灵敏度，各种具有模拟酶特性的纳米材料（如Au@Pt、Au@Pd、Pd@Pt、Au@PtPd、MOF-PdPt）被用来增强比色信号。但是，比色信号的输出依赖于台式酶标仪，这极大地限制了它们的POCT应用。针对上述问题，作者在这里设计了一种无需电源的生物传感器，使用微流控芯片、Au@PtPd纳米催化剂、一次性注射器和智能手机简单快速地检测沙门氏菌，能够在30
min内检测低至101.2 CFU/mL的沙门氏菌，具有成本低、集成度高、操作简单和便携性好等优点，展现出对致病菌进行POCT的潜在价值。如图1所示，微流控生物传感器由两个PDMS层和一个3D打印支架组成。首先，把该芯片的样品室、分离室、洗涤室和催化室分别断开，将带有免疫磁性纳米球（IMBs）和免疫Au@PtPd纳米催化剂（INCs）的细菌样本、洗涤缓冲液以及H2O2-TMB显色底物分别预加载到样品室、洗涤室和催化室中。然后，滑动顶层将样品室与分离室连接，用一次性注射器将细菌样品与IMBs和INCs的混合物通过ASAR微混合器来回移动，形成IMBs-沙门氏菌-INCs夹心产物，并在分离室中通过外磁场捕获。接着，滑动顶层将洗涤室与分离室连接，冲洗去除过量的INCs后，继续滑动顶层将催化室与分离室连接。最后，通过夹心产物上的INCs催化无色的H2O2-TMB显色底物产生颜色变化，通过智能手机app进行图像采集和处理以确定目标菌。![]()
图1. 用于生物传感的微流控滑片示意图，包括3D结构、检测机理和操作步骤
在微流控滑动芯片中，硅油被用于分离两层PDMS层并使其平滑移动来一步一步实现整个细菌检测程序。油层的厚度和通道的宽度对于滑块滑动以及无液体泄漏至关重要。从图2C的横截面图像来看，油层厚度大约20 μm。同时，制作了具有不同宽度（0.5、1和2
mm）、相同深度（1 mm）流体通道的PDMS层和菱形腔室，并用油层分隔来检查光滑性和泄漏性。将蓝色染料注入腔内，从图1D可以看出，当宽度为0.5 mm时，染料很难通过连接的通道流动，可能是因为通道太窄，表面张力很高。当宽度增加后，染料可以顺利地在通道中来回流动。但是2 mm宽的通道中容易出现硅油渗漏的问题。因此，通道的宽度和深度均设定为1 mm。后续滑动芯片依次连接不同的通道，并使用注射器来回移动染料，确保芯片的可行性。![]()
图2. 滑动芯片的结构与制备、优化过程
靶细菌与IMBs和INCs的结合主要依赖于ASAR微混合器的混合效果。利用分析软件COMSOL对ASAR微混合器进行模拟，从图3A可以看出，该微混合器表现出90%的出色混合效率。为了评估这种微量混合器的实际效果，将去离子水和红色染料注入腔室内，用注射器移动液体来回通过ASAR微量混合器。使用智能手机应用程序在不同的运动时间后收集图像，并使用ImageJ软件处理以获得它们各自的标准偏差。如图3C所示，混合效率随着来回运动的次数而增加，并且在第7次运动后达到超过90%。当混合时间为10 min或更长时，捕获效率达到95%，表明10 min对于目标细菌的特异性捕获是足够的（图3D）。相比之下，ASAR微混合器的混合效率显著高于没有微混合器的策略（71%）和静态孵育策略（36%），这归因于非对称结构和分裂-重组结构都能增强混合物的混合。而且，从图2F可以看出，当流速从0.5 mL/min增加到1.25 mL/min时，捕获效率基本保持在85-95%的范围内，表明流速对目标细菌的捕获没有明显的影响。![]()
图3. ASAR微混合器的性能表征
为了验证INCs的催化作用，将不同浓度的INCs用于催化H2O2-TMB底物，并且由自主开发的智能手机应用程序收集和处理图像以获得其饱和度。如图4A、B所示，饱和度随着INCs浓度的增加而增加，且与INCs浓度之间存在线性关系，证明了这一概念的可行性。在该生物传感器中，IMBs-细菌-INCs结合产物通过一步免疫反应形成，IMBs在与靶细菌的反应中可能与INCs竞争。因此，通过正交实验优化了两者的用量，选择20 μg的IMBs和15
μg的INCs。此外，根据图4D，催化5 min后，饱和度基本上保持在相同的水平，表明5
min的时间对于INCs催化H2O2-TMB底物是足够的。![]()
图4. INCs的模拟催化性能验证与条件优化
为了评估该生物传感器的灵敏度，在上述最佳条件下对2.0×101- 2.0×106 CFU/mL的沙门氏菌进行了三次平行测试。从图5A可以看出，催化物的饱和度随着细菌浓度的增加而逐渐增加。从图5B中可以观察到饱和度（S）和细菌浓度（C）的对数之间的线性相关性，表示为S
= 25.375×ln(C) - 54.17（R2= 0.98）。根据3倍信噪比计算出的检测限为101 CFU/mL。TEM成像进一步确认了IMBs-细菌-INCs夹心结合物的形成（图5C）。通过检测目标细菌、非目标细菌及其混合物，验证了该生物传感器的特异性。为了检验不同操作人员之间的差异，三名操作人员经过简单的培训后，使用该生物传感器分别检测相同浓度的目标细菌。图5E中，饱和水平基本相似，表明该生物传感器可以由不同的操作者操作。与传统的ELISA方法相比，这种微流控芯片将整个细菌检测程序集成到一个芯片上，避免了对专业实验室和训练有素的技术人员的要求。同时，通过简单的智能手机应用程序实现了比色信号的收集和分析，避免了对笨重仪器的需求。关键的是，这种生物传感器以8.9美元的价格在30 min内实现了细菌检测，提高了POCT应用的可能性。![]()
图5. 该生物传感器的灵敏度、特异性以及POCT应用的可行性分析
最后，通过检测牛奶和鸡肉样品中的沙门氏菌来评估该生物传感器的实用性。与培养板一同平行检测加标样品，并以该生物传感器的结果与培养板的结果之比计算回收率。如表1所示，牛奶样品的回收率在82%至115%之间，平均相对标准偏差小于11%，加标鸡肉样品的回收率在92%至110%之间，平均相对标准偏差小于12%。结果表明，该生物传感器在检测加标食品样品中的细菌方面表现出令人满意的适用性。表1. 使用该生物传感器检测加标鸡肉和牛奶样品中的沙门氏菌（N
= 3）
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在此，作者成功开发了一种用于沙门氏菌POCT的免电源比色型生物传感器。这种微流控芯片可以执行混合、分离、洗涤、催化和检测的整个细菌检测过程。其中的ASAR微混合器表现出良好的混合效果，并且Au@PtPd纳米催化剂被证实能够提高该生物传感器的灵敏度。该一体化生物传感器能够在30
min内检测2.0×102至2.0×105 CFU/mL的沙门氏菌，检测限为101.2 CFU/mL，并且由于其成本低、操作简单、设计紧凑和高度集成的特点，具有用于致病菌POCT的潜力。注：该文为最新科研动态新闻报道，如与原文作者有原创冲突，可与本公众号作者联系删除。
[1] An all-in-one microfluidic
SlipChip for power-free and rapid biosensing of pathogenic bacteria. Lab on a
Chip, 2024, 24, 4039.
