基于切口酶增强型RCA的便携式μPADs装置用于高危HPV感染的灵敏检测
文摘
科学
2024-07-05 11:12
浙江
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宫颈癌（CC）是由高危人乳头瘤病毒（HrHPV）持续感染引起的一种常见恶性肿瘤，对妇女健康构成重大威胁。目前，HPV核酸检测能有效筛查CC，降低死亡风险。当前的临床检测方法，包括聚合酶链式反应（PCR）、杂交捕获等，需要较高的设备、人员要求，普及度有限。因此，急需开发一种灵敏、快速和可负担的策略，用于在护理点（POC）环境下检测HPV核酸。HPV致癌基因E7
mRNA是一种在CC筛查中具有前景的候选基因。微流控纸基分析设备（μPADs）提供了一种便携，可负担的POC诊断方案。尽管与基于管的分析相比灵敏度较低，但是目前多种信号放大策略被集成到μPADs，大大提高了灵敏度。作为重要的等温扩增方法之一，RCA技术以其高效、简便、通用性强等优点成为生物传感领域的研究热门。利用环状模板和DNA或RNA引物，RCA可以在等温条件下实现对靶标的高灵敏度检测（范围从aM到pM，取决于RCA的特定类型）。通过最小化环状模板中的二级结构，RCA能在DNA解旋过程受阻的情况下扩增DNA，从而提高检测效率。同时，为了提高灵敏度，将切口酶与RCA结合开发了一种称为切口增强RCA（N-RCA）的高效扩增策略，但仍存在包括反应时间长和便携性有限（需要加热块和信号读出）的棘手问题。为此，作者利用切口酶和最小二级结构滚环扩增（N-MSSRCA）技术，在基于距离信号的微流控纸基分析装置（dμPAD）上建立了一种便携式定制荧光检测器，用于快速、灵敏地定量核酸。N-MSSRCA可以在一管中进行均相级联反应，同时实现目标分析物识别和信号放大。该级联反应有5个基本组分，包括T4 DNA连接酶、Phi29 pol、Nb.BbvCI切口酶，两个探针以及荧光染料。为了验证N-MSSRCA的性能，HPV16 E7 mRNA被用作模型分析物。在E7 mRNA逆转录产物（E7 cDNA）存在的情况下，触发后续的T4连接、切口酶水解、聚合和荧光染色反应，实现在单管内的靶标识别、MSSRCA引物生成、信号扩增。所产生的荧光信号可以通过微孔板阅读器进行定量，也可以通过dμPAD实现POC场景应用（图1a）。具体的反应机制如图1b所示，一旦缺口探针和结合探针与靶标正确杂交，T4 DNA连接酶就可以将两个功能化探针连接起来，从而启动级联反应。短引物结合到结合探针的3'端，然后通过Phi29 pol沿两个探针延伸形成双链连接产物。接着Nb.BbvCI识别缺口探针中的切割位点并切割DNA链。而缺口上方DNA链将从缺口位点再次延伸，根据Phi29 pol的链置换活性，短单链DNA被释放。并且，延伸、切割和链置换可以连续重复，引发了作为MSSRCA引物的Nicked片段（一级引物）的连续产生。这些Nicked片段与MSSRCA环状模板杂交并延伸导致DNA重复序列的快速生成。同时，缺口探针还能与MSSRCA产物的主链杂交，同时暴露3'端进行核苷酸裂解。这又将缺口探针转化为成熟的二级引物，以启动超分支化MSSRCA（H-MSSRCA）。最后，利用SYBR Gold可以观察到大量双链RCA扩增子。![]()
图1. N-MSSRCA的分子原理。(a)使用N-MSSRCA反应和便携式检测系统的总体工作流程。(b) N-MSSRCA的分子机制。
作者首先研究了两个探针的连接和N-MSSRCA系统第一步引物的生成过程。当靶标存在时才能产生延伸和相应的Nb.BbvCI消化产物，从而验证N-MSSRCA的可行性（图2A，line 8）。只有在靶标、DNA聚合酶和切口酶存在的情况下，才能获得连接产物（line
2）和正确大小的Nicked片段（line 8）。在缺乏缺口酶或目标分析物的情况下，没有观察到缺口片段的条带（~ 27 nt）（lane 4，lane 5）。从聚丙烯酰胺凝胶中进一步提取Nicked片段并用于触发MSSRCA。添加20 nM的Nicked片段后，在琼脂糖凝胶上产生了大量的MSSRCA产物（图2B），表明两个探针连接后在缺口酶和DNA聚合酶作用下成功产生了第一步MSSRCA引物。此外，图2C中1号泳道的条带比2号泳道的条带强得多，说明E7 cDNA的存在导致大量MSSRCA产物的产生。理论上，在没有E7 cDNA的情况下不应产生MSSRCA产物，这可能归咎于模板-聚合酶相互作用或切口酶-聚合酶相互作用，导致在没有目标分析物的情况下，出现少量的MSSRCA产物。![]()
图2. N-MSSRCA的可行性研究。
在优化等温反应条件后，作者评估了N-MSSRCA的分析性能，以定量HPV16 E7 mRNA合成的cDNA。基于荧光的N-MSSRCA检测能够在100 aM至100 nM的校准范围内检测核酸靶标，R2 = 0.89（图 3A），灵敏度低至1
fM（相当于56.5 CPs/μL）。相比其他的指数RCA策略，N-MSSRCA在较短时间内具有较高的分析灵敏度有两种可能的解释。首先，环状模板中二级结构的调控克服了RCA扩增子的拓扑限制，实现了DNA扩增产物的高效合成。其次，优化的缓冲条件使得连接反应的扩增步骤在相对较小的体积（20
μL）内完成，增加了局部目标浓度，从而提高了扩增效率。特别是反应缓冲液中PEG的存在，可以通过促进DNA-蛋白质相互作用（拥挤效应）来增加DNA聚合。基于连接反应的检测具有很高的特异性，甚至可以区分单核苷酸多态性（SNP）。为了阐明N-MSSRCA的特异性，作者合成并测试了单碱基错配T1、10%错配T2和20%错配T3（图3B）。对于10%和20%的错配序列，与阴性对照相比，浓度为100
pM时没有表现出明显的荧光。而单基错配序列荧光响应明显，但总体上低于完全匹配的目标（图3C）。作者还对不同DNA基质的连接产物进行凝胶电泳，显示存在E7 cDNA和T1的连接产物（图3D，lanes 2 and lane 4）。数据表明，T4 DNA连接酶不够敏感，不足以区分单碱基突变，但在错配时效率较低，这与以前的报告一致。由于HPV是一种低突变率的双链DNA病毒，对SNP的诊断需求不是必要的。![]()
图3. N-MSSRCA在E7基因检测中的分析性能评估。
测试完上述反应后，作者设计了一种低成本、便携式、集成N-MSSRCA和dμPAD的荧光信号读出装置。该系统通过纸上的荧光距离在分子水平上对HPV
E7 mRNA进行定量。dμPAD包含样品装载区和直接检测区，其中直接检测区使用蜡印机制造，以产生疏水屏障。基于dμPAD的DNA定量原理（图4A，B）依赖于DNA染料SYBR Green I与未经修饰的纤维素之间独特的界面相互作用。SYBR Green I与dsDNA的结合亲和力强于SYBR
Green I与纤维素的结合亲和力。这允许通过反应扩增将SYBR
Green I浓度依赖地洗脱到直接测试区，从而可以通过读取dμPAD上SYBR Green I的荧光距离来量化扩增产物。该设备能够执行N-MSSRCA并在dμPAD上可视化荧光信号（图4C），其中铝制热块实现温度调节，并通过蓝光激发实现dμPAD的可视化。该设备的正面配备了温度调节按钮和用于可视化显示的OLED屏幕。可充电和可互换的电池用作系统的电源。将dμPAD荧光读出系统与N-MSSRCA集成，可实现对E7 mRNA的免仪器检测。扩增产生的长链dsDNA由于有更多的SYBR Green I结合位点，是dμPad的理想靶标。操作过程如下，N-MSSRCA反应混合物首先被放置在加热模块内进行恒温扩增。然后，将N-MSSRCA扩增产物和荧光染料一起掺入dμPAD上，用蓝光激发进行可视化，产生与目标浓度成正比的荧光信号。为了标准化荧光距离的测量，使用ImageJ对dμPAD上的荧光分布进行了量化。基于3σ/斜率（σ为阴性对照的标准差），使用目测提供了13.25
fM的检测下限，使用Image J色谱图提供了14.11 fM的检测下限，证明了dμPad与N-MSSRCA分析的良好兼容性。![]()
图4. 便携式N-MSSRCA系统用于核酸POC检测的验证
使用从中山大学癌症中心获得的40个宫颈拭子样本来对N-MSSRCA系统的性能进一步评估。这些样本首先被提取并逆转录为cDNA进行进一步分析（图5A）。40例匿名宫颈拭子标本中，22例阳性，18例阴性。相比之下，N-MSSRCA系统能够用微板阅读器荧光检测22例（100%）阳性标本和16例（88.9%）阴性标本（图5B）。此外，使用便携式dμPAD系统，RT-qPCR阳性样本在dμPAD上的迁移距离比阴性样本更大，22例阳性样本中有21例（95.5%）阳性，18例阴性样本中有15例（83.3%）。随后使用dμPAD的数据构建的ROC曲线来评估该检测的临床性能（图5D）。dμPAD的AUC为0.9053（CI为0.7923~1.000），灵敏度为83.33%，特异性为95.45%，阈值为14.75 mm（荧光迁移距离）。临床性能指标表明所提出的N-MSSRCA系统在实际临床应用中具有潜在适用性。
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图5. 便携式N-MSSRCA系统的临床应用验证。
该研究提出了一种通用的方法，利用便携式信号读出平台快速、灵敏地诊断HPV16
E7 mRNA，不需要训练有素的技术人员和最少的人工干预。N-MSSRCA包含了三种增强信号的机制：（1）探针连接后产生的多个引物生成事件；（2）设计的无二级结构的环状模板能够高效生产RCA扩增产物；（3）将缺口探针转化为MSSRCA的二级引物，启动二级指数DNA扩增。虽然文中仅展示了对HPV16
E7 mRNA逆转录产物的检测，但在连接反应中通过特殊设计的两个探针，该系统可以适用于任何核酸靶标。未来该系统可以通过快速的样品制备得到进一步的改进，以实现“样品输入，结果输出”的模式。
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[1] Portable Device with Nicking Enzyme Enhanced Special RCA on μPADs toward Sensitive Detection of High-Risk HPV Infection. Anal. Chem., 2024, DOI: 10.1021/acs.analchem.4c02070.
