1.SEDphone平台原理
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图1 SEDphone系统工作流程示意图
SEDphone平台由一个完全集成的离心微流控芯片、双温模式加热模块和一个光学检测模块组成。芯片被分为八个单元，每个单元包括LAMP扩增室和CRISPR/Cas12a检测室。样品加到芯片后分别在扩增室和检测室反应（图a），当特定单元出现明亮荧光信号表明样品属于相应亚型，实现对多重靶标的有效识别。2.LAMP-CRISPR/Cas12a多重检测系统
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图2 LAMP-CRISPR / Cas12a多重检测系统的性能研究
为了方便应用于不同的靶标，他们基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统开发了一个通用的设计流程（图a）。首先从NCBI获得五种流感病毒亚型的序列并确保序列保守性，对每种亚型都筛选出切割效率高的crRNA用于后续LAMP引物筛选。然后对筛选出的LAMP引物进行扩增效率和灵敏度测试，选出最佳的LAMP扩增引物。通过5×5矩阵测试（图b）验证的crRNA和LAMP引物的特异性，结果显示特异性好，没有交叉活性（图c）。然后对1000、100、10
copies/μL的质粒样本进行LAMP扩增和CRISPR/Cas12a检测，结果显示每个亚型的敏感度为10 copies/μL。3.离心微流控芯片的表征
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图3 离心式微流控芯片的结构
离心式微流控芯片由三层组装而成，中间的流体层采用PMMA材料制成，两侧的盖层和密封层由光学透明度良好、粘合性能强的压敏胶PSA材料制成（图a）。圆盘的中心轴与离心设备的加热块及旋转轴匹配，整个圆盘对称分布着8个相同的反应单元，每个反应单元包括储液池、第一连接通道、扩增腔室、第二连接通道、缓冲腔以及检测腔（图b），扩增腔和检测腔预先嵌入试剂，储液池则采用玫瑰花型设计，使样品可以均匀填充到每一个样品池中。为了确保流体可以通过不同的离心力在不同时间进入扩增室和检测室，他们对第二连接通道进行优化（图d），当第二连接通道为直流结构时，流体会同时进入扩增室和检测室，然而采用弯曲结构后，流体进入两个腔室的离心力存在显著差异，成功实现了两步反应（图e）。4.便携式智能手机设备平台设计
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图4 基于智能手机APP的设备
为了实现便携式检测，他们设计了一款智能手机设备及安卓手机应用程序（图a,b），应用程序有三个操作界面（图d），TEMPERATURE界面用来设置温度，CAPTURE界面捕获荧光图像和采集参数，ANALYZE界面检测荧光值并定性检测。图e对SEDphone荧光检测性能进行测试，结果显示相同浓度的荧光染料具有相似的荧光强度。图f表明荧光强度与FAM染料直线存在线性关系。5.双温模块
由于RT/LAMP扩增和CRISPR/Cas12a的反应温度不兼容，所以他们使用热传导的传热方法，利用一个铝热块来实现双温控制，图a为使用COMSOL对双温区的模拟结果。然后他们用红外热像仪检测温度分布（图b）并绘制了温度的三维表面图（图c），结果显示扩增室和检测室与加热器温度呈线性关系（图d,e），且不同单元之间反应温度一致（图f）。红外图像（图g）显示芯片表面温度在3分钟内稳定（图h）,扩增室温度稳定在62℃，检测室温度稳定在42 ℃。![]()
图5 双温区模块的性能测试
6.SEDphone平台的临床验证
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图6 检测流感病毒临床样本分型的SEDphone平台
为了评估SEDphone的临床实用性，他们使用38个样本进行测试，其中包括22个感染流感病毒的阳性样本和16个阴性样本，分别使用qRT-PCR方法和SEDphone平台分别检测（图a），图b以临床样品No.2为例，表明该平台没有假阳性和假阴性的结果，且H3N2单元的荧光强度高于阴性单元，表明为H3N2亚型。图c、d结果表明SEDphone平台与qRT-PCR方法得出的结果一致，说明该平台在临床研究中应用是可靠的。
