核酸适配体功能化的场效应晶体管生物传感器用于单细胞水平的食源性致病细菌快速检测
文摘
科学
2024-06-21 10:34
浙江
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由沙门氏菌（Salmonella enterica, S. enterica）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）引起的食源性疾病对人类健康造成了显著影响。S. enterica具有多种血清型，是人畜共患食源性疾病的主要致死原因。S. aureus约占食物中毒事件的四分之一，易产生耐热毒素，给食品安全带来艰巨的挑战。针对食源性致病细菌的现有检测技术主要包括培养法、以ELISA为代表的免疫检测法、以PCR为代表的核酸检测法，均面临着操作繁琐、灵敏度受限、检测效率低等问题，这使得食品样品中痕量细菌的检测尤为困难。因此，亟需一种无标记、灵敏、快速的检测技术以实现有效的病原体识别。场效应晶体管（Field-effect transistor, FET）以其高灵敏度、高特异性、快速响应、易于集成和低成本等优势在食品安全监测领域受到了广泛的关注。核酸适配体因其显著的稳定性和对靶标分子的高亲和力而备受认可，由于分子量较低，它能够绕过静电屏蔽问题，从而显著提高FET生物传感器的性能。FET平台与核酸适配体的结合将有望为食源性致病细菌的检测提供一种有效的技术手段。基于此，华南农业大学王丽教授和北京大学肖梦梦助理研究员团队开发了一种基于碳纳米管（Carbon nanotubes, CNT）的FET生物传感器，以实现对S. enterica和S. aureus在单细胞水平的检测。该项检测技术将为多种环境中食源性致病细菌的高效监测提供一种潜在的方案，相关研究成果发表于Biosensors and Bioelectronics上。![]()
图1. CNT-FET生物传感器工作原理示意图
1. CNT-FET生物传感器的制备与表征
如图2a所示，CNT-FET生物传感器的主要结构包括一个源极和漏极，并由充满CNT的中央通道（40 * 40 μm）进行连接。其中，在Y2O3层上通过金纳米粒子（AuNPs）覆盖了一层0.6 nm的金膜，并且为了保持传感器的稳定性，所有金属接触点都涂覆了一层光刻胶，防止电流泄漏和电化学反应。如图2b所示，通过测量80个未修饰核酸适配体的传感器电学性能，发现具有较为一致的p型FET行为和高电流开/关比，表明所使用的CNTs具有优越且稳定的电子迁移率，有助于CNT-FET生物传感器的大规模生产。图2c展示了生物传感器表面核酸适配体修饰的基本原理与选择性识别S. enterica或S. aureus的基本流程。图2d-f展示了X射线光电子能谱的表征结果，修饰后传感器上的硫（S2p，164.6 eV）、磷（P2p，132.7 eV）和氮（N1s，399.5 eV）水平增加，表明核酸适配体成功通过Au-S键成功附着到传感器表面。荧光显微镜图像（图2g）进一步验证了修饰效果，仅在AuNPs覆盖的通道区域显示出明显的荧光，明确了核酸适配体的靶向结合。扫描电子显微镜图（图2h, i）则捕捉到了附着在传感器通道上的S. enterica和S. aureus的特定形状，表明该生物传感器借助核酸适配体具备特异性捕捉靶标细菌的能力。![]()
图2. CNT-FET生物传感器基本结构与功能化表征
2. 缓冲液中CNT-FET生物传感器检测性能表征
本文首先表征了CNT-FET生物传感器在PBS缓冲液中的检测性能。如图3a-f所示，以PBS缓冲液作为液门和结合环境的条件下，CNT-FET传感器在捕获靶标细菌后，电流值显著增加，传输曲线符合p型器件的特性。将静态检测期间的传感器响应信号定义为ΔIds（ΔIds = Ids - Ids0）。如图3c和3f所示，CNT-FET传感器信号对S. enterica和S. aureus的浓度表现出线性响应，静态LOD分别为50.56 CFU/mL和64.19 CFU/mL，相当于约1 CFU/反应，实现了单细胞水平的检测灵敏度。这些结果表明，核酸适配体功能化的CNT-FET生物传感器系统不需要额外的放大策略，通过简单的稀释与孵育即可实现对这些细菌的超灵敏检测，图3g揭示了传感器识别与信号转导的基本原理，靶标细菌与传感器的相互作用导致核酸适配体从伸展结构转变为折叠结构，使负电荷区域更接近CNT通道，该机制以及细菌结合时固有的负电荷，导致了漏极电流的增加。图3h和3i展示了检测特异性，CNT-FET生物传感器能在核酸适配体的辅助下精准识别S. enterica或S. aureus靶标细菌，而对于其他常见病原细菌则没有产生明显的信号（***p < 0.001）。本文后续则对CNT-FET在PBS缓冲液中实时检测S. enterica和S. aureus的能力进行了评估，以确定其在快速病原体识别中的有效性。将5 μL细菌溶液样品间隔100-200秒加入CNT-FET传感器中，图3j和3k展示了归一化电流的变化情况。这种设置表明CNT-FET传感器具备快速检测细菌的能力，在200秒内能够实现最低625 CFU/mL（约3.1 CFUs）的细菌检测。![]()
图3. 缓冲液中CNT-FET生物传感器检测性能表征
3. 食物样本中CNT-FET生物传感器检测性能表征
接下来，本文评估了CNT-FET传感器在食物样品中对S. enterica和S. aureus的快速检测能力。图4a和4b展示了两种细菌（625–10000 CFU/mL）在三种肉类样本（猪肉、鸡肉、牛肉）中的实时检测现象。结果表明，在未污染的阴性样品中电流信号变化较小，而引入受污染的阳性样品将引起电流的显著增加，表明存在细菌，LOD可达3.1 CFUs。此外，为了考察CNT-FET传感器在不同类型食品样品基质中快速检测细菌的能力，本文对人工污染的牛奶、鱼和鸡蛋样品进行了实时监测。如图4c-4h所示，引入PBS空白和阴性样品仅导致轻微的电流波动，而阳性样本能产生明显的电流信号。上述结果表面该生物传感器在不同类型食物样本中均具备对S. enterica和S. aureus进行快速、灵敏和特异性检测的潜力。![]()
图4. 食物样本中CNT-FET生物传感器检测性能表征
最后，本文对该生物传感器在人工污染的食物样品中对S. enterica和S. aureus的静态检测灵敏度和稳定性进行了评估。图5a-5d表明，猪肉、鸡肉和牛肉样本中S.
enterica的LOD分别为11.4 CFUs、10.2 CFUs和9.5 CFUs，牛肉样本中S.
aureus的LOD则为14.7 CFUs。因此食品基质的复杂性可能会略微增加细菌检测阈值，潜在影响适配体-细菌结合的效率，从而影响生物传感器的灵敏度。本文通过分析24个肉类样本（部分受到特定细菌水平的污染，另一部分则未受污染），评估了CNT-FET传感器在食品样品中检测S. enterica和S. aureus的稳定性。如图5e-5h所示，传感器能够准确区分阴性样本与阳性样品，体现了高度的稳定性、特异性和可靠性。![]()
图5. CNT-FET生物传感器实际应用性能评估
针对食品样品中的S. enterica和S. aureus，本文利用核酸适配体功能化CNT-FET生物传感器实现了单细胞水平的高灵敏度、高特异性快速检测。在缓冲液中的检测限可达1 CFU，在六种类型的食品样本中检测限则为15 CFUs。此外，该生物传感器可在200秒内完成实时检测，具备出色的特异性和抗干扰能力，确保了检测结果的准确性。以上检测性能归因于几个关键因素：（1）CNT网络膜可以超灵敏地检测到微弱的电荷变化，并具有较高的电子迁移率，为高灵敏度和快速检测奠定了基础；（2）Y2O3薄膜减少了电荷干扰，增强了CNT的功能；（3）与平面通道相比，AuNPs增加了特定表面积，可修饰更多的核酸适配体；（4）巯基修饰的适配体确保了稳定和特异性结合。这些特点表明，该生物传感器将有望为食源性致病细菌的检测和控制提供一种快速、灵敏、经济的实时监测手段。
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[1] Ultra-sensitive and rapid detection of Salmonella
enterica and Staphylococcus aureus to single-cell level by aptamer-functionalized carbon nanotube field-effect
transistor biosensors. Biosensors and Bioelectronics, 2024, 257,
116333.
