DNA或RNA靶标结合激活Cas9的反式核酸酶活性
文摘
科学
2024-06-07 10:23
浙江
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第2类CRISPR-Cas系统具有简单的效应蛋白组成和高效的核酸切割活性，已成为基因编辑和核酸检测的实用工具。其中Ⅴ-A型的Cas12a与VI-A型的Cas13a已展现出了两种底物切割模式，包括对靶标的顺式切割和对非靶标底物的反式切割。通过将Cas12a或Cas13a的反式切割活性与等温扩增相结合，已出现了多种核酸检测平台，例如DETECTR、SHERLOCK。在引入反转录、链置换、转录等步骤后，上述检测平台已实现了对DNA和RNA的高灵敏度检测。但Cas12或Cas13a对靶标的识别与切割依赖于PAM或PFS位点。虽然PAM和PFS位点能够提高检测的准确性，但严重限制了靶标的选择区域，从而限制了其应用前景。同时，Cas12a的反式切割活性能够被轻易激活，与crRNA互补的14nt ssDNA即可激活。对于ssDNA激活剂，crRNA与ssDNA的双错配对反式切割活性的影响较小；对于dsDNA激活剂，只有出现在PAM位点附近的“种子区”的双错配才能抑制Cas12a的反式切割活性。这些特性可能会削弱其用于诊断致病性突变时的单碱基分辨率。反式切割活性已在Ⅴ型、Ⅵ型Cas蛋白中发现，但在Ⅱ型Cas蛋白中尚未发现。ssDNA靶标的结合能够诱导LbCas12a-crRNA复合体对M13噬菌体基因组的快速降解，而SpyCas9（Streptococcus pyogenes Cas9）-sgRNA复合体无法实现。但目前尚无法分辨Cas9确实缺失反式切割活性还是在识别和切割底物时具有序列特异性；且crRNA与tracrRNA对反式切割的影响尚未被揭示。鉴于Cas蛋白的反式切割活性在核酸检测平台构建中所占据的关键地位，进一步表征Cas9的反式切割活性并构建相关检测平台具有重要意义。基于此，厦门大学刘亮教授课题组首次揭示了Cas9由crRNA和tracrRNA引导的反式切割活性，且靶标DNA/靶标RNA与Cas9的结合均可触发其对于ssDNA/ssRNA的无差别切割活性。根据该特性，研究团队开发了基于Cas9反式切割活性的新型核酸检测平台，具备高灵敏度及高特异性，实现了对多种病毒和肿瘤耐药性突变的检测。相关成果以“Trans-nuclease
activity of Cas9 activated by DNA or RNA target binding”为题发表于Nat. Biotechnol.。（DOI: 10.1038/s41587-024-02255-7）。1、验证Cas9对于ssDNA的反式切割活性
Cas12a和Cas12b均利用单个RuvC结构域实现对dsDNA靶标的顺式切割和非特异性ssDNA的反式切割。Cas9同样具有该结构域，且靶标dsDNA非互补链的顺式切割已被证明在该结构域进行。通过比较SpyCas9-sgRNA-target
strand（TS）复合体与结合非特异性ssDNA后的AacCas12b（Alicyclobacillus acidoterrestris Cas12b）复合体的RuvC结构域，研究团队发现Cas9的RuvC结构域具有容纳ssDNA的潜力（图1a）。类似于Cas12a、Cas13a，Cas9对非特异性的均聚ssDNA底物具有底物结合偏好性和切割偏好性。研究团队发现SpyCas9偏好于结合、切割poly（T）/poly（C），对poly（A）/poly（G）几乎没有切割活性（图1b，c）。FnCas9（Francisella
novicida Cas9）、SauCas9（Staphylococcus aureus Cas9）也展现出了相同的偏好性，且对poly（T）的切割活性最高（图1d）。而由上述均聚ssDNA形成的dsDNA底物无法顺利被Cas9切割（图1e），证明Cas9只能有效地反式切割富含T或C的ssDNA底物，不能像Cas12a、Cas12b一样对dsDNA底物进行反式切割。![]()
图1 Cas9对poly(T)/poly(C) ssDNA具有反式切割活性
（a）SpyCas9-sgRNA-TS复合体的结构（b）微量热泳动实验比较SpyCas9-sgRNA-TS复合体与poly(A)、poly(T)、poly(C)、poly(G)之间的相互作用（c）SpyCas9-sgRNA-TS复合体对cy3标记ssDNA均聚物的反式切割（d）不同Cas9对不同ssDNA均聚物的反式切割；（e）SpyCas9-sgRNA-TS复合体对dsDNA的反式切割
2、由crRNA和tracrRNA引导的反式切割
使用嵌合sgRNA代替crRNA、tracrRNA对Cas9的顺式切割活性几乎没有影响，但有可能会影响其反式切割活性。结果表明，由crRNA、tracrRNA引导的spyCas9对poly(T)/poly(C)具有较强的切割活性，对poly(A)具有较弱的切割活性，对poly(G)几乎没有切割活性(图2a,b)。值得注意的是，sgRNA引导的SpyCas9完全酶切poly(T)底物需要30 min，而crRNA、tracrRNA引导的SpyCas9完全酶切仅需4 min(图1c，2a)。研究团队发现crRNA、tracrNA引导的反式切割效率为sgRNA引导的反式切割活的6-95倍；且ssDNA激活的Cas9反式切割活性优于dsDNA激活的反式切割活性（图2c)。此外，研究团队检测了Cas9对于其他序列ssDNA的反式切割活性。在被ssDNA激活后，sgRNA引导的Cas9不能催化对M13噬菌体DNA的降解；但在相同条件下，crRNA、tracrRNA能够引导Cas9将其完全降解（图2d）。虽然在crRNA、tracrRNA的引导下，Cas9仍无法实现对dsDNA的反式切割，但其成功对含有随机序列的ssDNA展开反式切割（图2e）。上述结果表明Cas9具有crRNA、tracrRNA引导的、由DNA激活的反式ssDNA切割活性。![]()
图2 crRNA和tracrRNA介导的Cas9的反式切割活性
（a）（b）SpyCas9-crRNA-tracrRNA复合体对cy3标记ssDNA均聚物的反式切割（b为37 ℃孵育20 min）（c）crRNA-tracrRNA与sgRNA引导的反式切割动力学参数比较（d）SpyCas9-crRNA-tracrRNA复合体和SpyCas9-sgRNA复合体对M13噬菌体DNA的反式切割活性（e）SpyCas9-crRNA-tracrRNA对随机序列dsDNA和ssDNA的反式切割活性
3、反式切割的序列和结构偏好性
研究团队发现ssDNA底物中poly(T)/poly(C)的序列长度对反式切割活性具有显著影响（图3a、b），含有大于10个连续T或12个连续C碱基的底物能够在10 min内被Cas9完全切割。进而，研究团队探究了ssDNA底物的二级结构是否会影响反式切割。结果表明，无论poly(T)/poly(C)位于茎部还是环状结构，Cas9都难以降解形成茎环结构的ssDNA底物；但若poly(T)/poly(C)位于茎部的5′或3′侧翼区，Cas9对其有很强的切割活性（图3c）。证明Cas9优先切割含有多个不参与形成复杂二级结构的T/C碱基的ssDNA底物。研究团队利用含有poly(T)/poly(TC)/poly(TA)/poly(A)的合成噬菌体ssDNA，进一步证实了Cas9的底物偏好性(图3d)。Cas9对含有poly(T)/poly(TC)/poly(TA)的底物表现出较强的反式切割活性；当底物中的poly(T)被poly(A)替换后，Cas9的反式切割活性明显减弱(图3e-g)。值得注意的是，由于RuvC结构域同时负责ssDNA的反式切割外及靶标dsDNA中非互补链的顺式切割，因此Cas9对两者展现出了相同的序列偏好性。![]()
图3 Cas9对非特异性ssDNA的序列及结构偏好性分析
（a）（b）非特异性ssDNA 3’端T/C碱基数量对SpyCas9的反式切割效率的影（c）SpyCas9对发夹结构ssDNA的反式切割（d）两种长链非特异性ssDNA的序列结构（e）（f）不同反应条件下SpyCas9对LT1的反式切割（g）比较crRNA-tracrRNA诱导下SpyCas9对LT1和LA1的反式切割活性
4、DNA或RNA靶标结合触发反式切割
研究团队发现三种激活剂（靶标ssDNA、dsDNA、ssRNA）均能激活Cas9的反式切割活性（包括ssDNA、ssRNA），且ssDNA表现出比其余两者更高的激活效率（图4a-d）。当使用靶标ssDNA或dsDNA作为激活剂时，Cas9对ssDNA底物的切割效率约为ssRNA底物的18倍或48倍（图2c，图4e，f）。故而Cas9的非特异性ssDNase活性强于ssRNase活性。为了探究RNA靶标触发的Cas9反式切割活性弱于ssDNA触发的反式切割活性的原因，研究人员测定了SpyCas9-sgRNA-靶标RNA复合体的晶体结构（图4g-i）。如图中所示，sgRNA-靶RNA双链被容纳在识别(REC)区域和核酸酶区域之间的空隙内。![]()
图4 靶向结合激活SpyCas9的反式切割活性
（a）（c）不同靶标激活SpyCas9对ssDNA/ssRNA反式切割活性的反应动力学（b）（d）RuvC（D10A）、HNH（H840A）结构域突变对SpyCas9的ssDNA/ssRNA反式切割活性影响（e）（f）使用靶标ssDNA和dsDNA作为激活剂时，Cas9对ssRNA的切割效率比较（g）SpyCas9的结构组成（h）用于结晶的sgRNA和靶标RNA结构示意图（i）SpyCas9-sgRNA-靶RNA复合体的结构
其触发活性较弱的原因可能为：（1）Cas9与靶ssDNA结合后，REC2、REC3、NHN结构域均发生了显著变化（图5a），而与靶RNA的结合只导致REC3结构域出现了显著改变（图5b）；（2）Cas9中sgRNA-靶ssDNA的双链结合通道比sgRNA-靶RNA的双链结合通道更紧凑(图5e)；（3）sgRNA-靶DNA和sgRNA-靶RNA双链体之间存在明显的构象差异（图5f)。![]()
图5 SpyCas9-sgRNA-靶ssDNA和SpyCas9-sgRNA-靶RNA的结构比较
5、利用CRISPR-Cas9构建核酸检测平台
在上述研究基础上，研究团队结合PCR和Cas9的反式切割活性，开发了一种能够检测DNA的Cas9检测平台——DACD（图5a）。他们利用猴痘病毒细胞外囊泡蛋白B6R的编码基因来考察该平台的灵敏度，检测灵敏度达到24 拷贝/μL(图5b,c)。此外，鉴于靶标RNA也能激活Cas9的反式切割活性，研究团队结合T7转录、RAA等温扩增开发了另一种能够检测RNA的检测平台——RACD(图5d)，对于B6R基因的检测灵敏度达到2.4 拷贝/μL（图5e,f）。由于RACD无需依赖PAM位点，与等温扩增技术更易兼容，研究团队进一步利用RACD检测猴痘病毒BR6-假病毒，RACD在2 h内实现了3.7 拷贝/μL的灵敏度(图5g)。对于RNA病毒——呼吸道合胞病毒A（RSV-A），RACD在2.5 h内能达到98个拷贝/μL的灵敏度(图5h）。研究团队进而表征了RACD、DACD的检测特异性。由于猴痘病毒种内序列相似性极高，研究团队选用了一条与靶序列的向导RNA互补区存在3个碱基差异的序列进行种属特异性鉴定，RACD和DACD均展现出了较好的特异性（图5i）。通过上述实验，研究团队发现当靶DNA与crRNA之间存在18nt的互补序列时，靶序列第17位的错配显著降低了Cas9的反式切割活性。基于此，他们建立了一种具备通用性的单核苷酸多态性(SNP)检测方法，即通过在18nt目标序列的第17位引入一个错配碱基来区分单碱基突变。研究团队探索了Cas9检测是否可以用于区分痘病毒的两个遗传分支（即刚果盆地(CB)分支和西非(WA)分支），两分支在选定的目标区域内仅存在单碱基差异(图5i）。当使用靶向CB的crRNA时，DACD和RACD在检测CB分支时表现出稳健的荧光信号，而在检测WA分支时表现出可忽略不计的荧光信号，证明了该方法能够有效区分CB与WA。研究团队还尝试将该方法应用于低丰度突变检测。检测突变为EGFRT790M突变，该突变为导致非小细胞肺癌治疗中酪氨酸激酶抑制剂耐药的最常见机制，研究团队发现该方法能够在野生型DNA样本中检测到0.1%的T790M突变(图5j)。![]()
图5 Cas9介导的核酸检测平台的特异性及灵敏度
（a-c）DACD原理示意图及检测灵敏度表征（d-f）RACD原理示意图及检测灵敏度表征（g）RACD检测猴痘病毒B6R-假病毒（h）RACD检测RSV-A（i）左：不同种猴痘病毒靶RNA序列及crRNA序列示意图，右：RACD对猴痘病毒CB分支的检测特异性表征（j）左：野生型EGFR、突变型EGFRT790M的序列和crRNA序列示意图，右：RACD检测突变基因的灵敏度表征
（1）研究团队首次揭示了Cas9的反式切割活性，并发现Cas9在crRNA、tracrRNA引导时展现出比sgRNA引导时更高的反式切割活性，且Cas9对于非特异底物的反式切割及非互补链的顺式切割具有相似的切割机制；（2）研究团队构建了RACD、DACD两种基于Cas9反式切割活性的检测平台，并利用Cas9对互补序列第17位碱基错配的高敏感度实现了SNP检测及1%低丰度突变检测；（3）虽然Cas9、Cas12a、Cas13a具有不同的底物亲和力与底物催化效率，但他们对RNA/RNA的免扩增检测具有相似的检测限；Cas9免扩增检测平台相较于Cas12、Cas13a免扩增检测平台具有可识别靶标类型多样、可选用报告分子类型多样、削弱对PAM/PFS位点依赖等优点；（4）但基于Cas9的检测需利用双向导RNA实现高灵敏度检测，仍存在优化空间，例如引入改造后Cas9、使用优化后向导RNA、结合其他样品前处理方法等。
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[1] Trans-nuclease activity of Cas9 activated by DNA or RNA
target binding. Nat Biotechnol, 2024, DOI: 10.1038/s41587-024-02255-7.
