1.三聚体适配体的制备和电化学表征
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图1 实时相互作用动力学分析靶标结合过程
TMSA52（图1a）是一种三聚体适配体，其中MSA52是该课题组使用SELEX技术筛选到的新冠病毒及其变体的适配体，三个MSA52结合到树枝状大分子上，另一端连接一个生物素。生物素可以链霉亲和素结合，因此通过生物素与链霉亲和素修饰的电极相连对反应进行实时监测。如图1b所示，TMSA52可与悬浮在溶液中的病毒蛋白（OPV）结合，形成适配体-靶标复合物。然后复合物通过生物素与链霉亲和素修饰的工作电极结合，使用单频电化学阻抗测量（SEIM）技术实现原位、一锅电化学读出（图1c），提出了一种结合SEIM、多聚适配体和检测试剂的实时荧光定量核酸适配体（RT-MAp）检测方法。图1d表示空白溶液和含目标分子溶液与电极结合的测量状态，图1e是使用SEIM对RT-MAp方法在这两种溶液中的效果进行评估，信号值|ΔZ/Z|与电极表面绝缘程度有关，绝缘程度越大，信号值越大。对于空白溶液可以看出信号值在18min达到峰值后下降，对于含目标物的溶液，信号值与空白对照相比高了3.8倍，这是因为TMSA52-OPV复合物携带更多的绝缘材料，导致信号值增加幅度更大。22分钟后，空白组和靶标组的信号都有所降低。2.RT-MAp方法对真实唾液样本的检测限
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图2 RT-MAp方法对预热唾液样本中OPV的检测限
研究人员对真实唾液样本进行检测，发现对样本稀释10%后仍然有很高的背景信号以及复杂动力学趋势，他们推测是由于唾液酶降解电极表面DNA或链霉亲和素引起的。于是他们对稀释后的样品在60℃下进行预热，结果显示预热可以减少唾液成分的干扰。因此他们对添加过OPV的缓冲液（图2a,b）和预热唾液样本中OPV（图2c,d）的检测限进行分析，当缓冲液中OPV浓度在103 copies/ml及以上时，含靶标溶液的信号值远高于空白对照。在真实唾液样本中也有相同趋势，只是在真实唾液样本中，当OPV浓度为104 copies/ml时，信号值增加速率更高。总之，唾液样本检测限（701 copies/ml）比缓冲液的检测限（155 copies/ml）更高，这可能是由于唾液蛋白干扰导致的。3.RT-MAp方法的普适性和特异性
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图3 RT-MAp方法检测甲型流感（InfA）病毒H3N2亚型（AV-H3N2）
甲型流感病毒（Influenza
A）是一种与新冠病毒类似的呼吸道疾病，对人体致病性强，曾引起多次世界大流行，其表面具有多种抗原，包括血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。为了评估RT-MAp方法的普适性，他们将RT-MAp方法用于甲型流感病毒，如图3a所示，他们合成了一种新的三聚体适配体（TRHA06），该适配体可以与甲型流感病毒H3N2亚型的血凝素（HA）结合，且亲和力比单体适配体提高了93倍（图3b,c）。研究人员使用加标唾液样本（AV-H3N2）对RT-MAp方法的检测限进行评估（图3d,e），尽管检测限（1043
copies/ml）达到了要求，但是与检测新冠病毒的RT-MAp方法相比，该方法信号更低，动态范围更窄，检测时间更长。这可能是因为TRHA06与靶标的亲和力低于TMSA52与OPV的亲和力。![]()
图4 评估RT-MAp方法对SARS-CoV-2和InfA的特异性
研究人员对RT-MAp方法的特异性以及在混合样本中识别特定靶标的能力进行分析，将人冠状病毒229E（229EV）、人冠状病毒OC43（OC43V）、AV-H3N2和腺病毒（AdV）进行攻毒试验，观察其对新冠病毒的特异性（图4a），结果显示OPV与其他其他呼吸道病毒的交叉反应很小。然后他们将两种针对新冠病毒和甲型流感病毒的RT-MAp方法用于含靶标分子的混合物，分析其识别特异性靶标的能力（图4b,c），结果显示TMSA52对AV-H3N2和TRHA06对OPV均无交叉反应。然而当分析混合物时，信号比存在一个特定目标的溶液更低，可能是由于干扰物种破坏了三聚体适配体的高亲和力。4.将RT-MAp方法与机器学习结合并用于临床决策
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图5 将RT-MAp方法与机器学习结合用于临床决策
最后研究人员评估了针对新冠病毒设计的RT-MAp方法在临床应用中的性能。对37份新冠临床样本进行检测，首先将唾液样本预热并装入含有分析试剂的试管中，然后将溶液滴加在电化学芯片上，最后使用集成恒电位仪的智能手机读取数据（图5a）。图5b表示每个样品每分钟的动力学数据，并根据PCR反应数据将其分为阳性组和阴性组（图5b），结果表明在分析早期，阳性、阴性样本之间存在重叠，重叠会随着时间推移而逐渐消失。基于图5b中的数据描绘的受试者工作特征（ROC）曲线可以看出表现灵敏度和特异性的关键时间点（图5c-d）。灵敏度从2 min时的55%增加到18 min时的91%，且直到30 min时，灵敏度保持在91%；特异性从2 min的61%增加到8 min的100%，直到18 min保持100 %不变后略有波动。由于阴性样本和阳性样本内部数据存在较大的离散幅度，研究人员采用了非线性回归算法，这种算法是一种用于曲线拟合的无需监督的机器学习算法（图5e），他们从阻抗动力学数据中提取九个特征量用于机器学习算法，该算法将九维特征空间压缩为二维主成分，并将二维主成分数据集输入到向量机中对数据进行分类，该模型的训练使用了67%的临床数据，对剩余33%的数据进行分类，结果显示该模型具有较好的准确性，达到100%的灵敏度和特异性（图5e(i)-(ii)）。
