1. CRISPR驱动的AIEgen发光输出
![]()
图1 CRISPR驱动的AIEgen发光输出系统
阳离子AIEgens染料可以通过静电或非共价相互作用与带负电荷的DNA链相互作用，从而激活RIM作用输出荧光。作为一种阳离子AIEgens，TPBT具有4个带正电的吡啶基团，可用于dsDNA和单核苷酸多态性的无标记荧光检测。与广泛使用的荧光团FAM相比，TPBT具有更大的Stokes位移（图2a）和更好的抗光能力（图2b）,有利于灵敏准确的检测。由于Cas核酸酶对ssDNA的反式切割活性，他们设计了两种修饰有AIEgen的ssDNA，即ssDNA/AIEgens和Q-ssDNA/AIEgens。与柔性ssDNA相比，刚性dsDNA可以更有效地限制AIEgens的分子内运动，从而增强荧光，因此构建了两个AIEgens修饰的dsDNA，即Q-dsDNA/AIEgens和Q-dsDNA/AIEgens-Q，并与商业化合成的FQ报告基因Q-ssDNA-FAM进行比较。使用S1核酸酶作为活化过的Cas核酸酶的替代品，图2c表明S1核酸酶的存在使FAM荧光恢复，也会使修饰了AIEgens而无猝灭基团的ssDNA发生“on-off”式的信号输出（图2e），相比之下，Q-ssDNA/AIEgens在S1核酸酶作用下恢复荧光信号，产生“off-on”式的信号输出（图2f）。与dsDNA孵育后，TPBT荧光信号明显增强，在dsDNA的一端或两端标记BHQ猝灭基因可以有效猝灭荧光，加入S1核酸酶后BHQ脱离，荧光恢复，获得“off-on”式的信号输出（图2d,g,h）。然后研究团队将CRISPR/Cas系统与AIEgens荧光输出相结合，开发出CRISPRAIE系统，对DNA序列的碱基类型、序列长度等进行优化，并得出四种信号报告分子的检测限分别为12
pM、195pM、0.37pM和0.18pM（图2i,j,k,l）。2. CRISPRAIE联合RT-RPA进行RNA定量
![]()
图2 RT-RPA与CRISPRAIE组合检测诺如病毒RNA
研究团队利用重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）对实际样品（如呕吐或鼻咽拭子）中提取的RNA进行逆转录和等温扩增，Cas12a、crRNA组成的二元复合物与逆转录扩增子结合，反切Q-dsDNA/AIEgens-Q从而产生荧光信号，整个检测系统集成于一个单管中（图3a）。只有靶标RNA与RPA结合才能获得荧光信号响应（图3b）,且与基于Q-ssDNA-FAM的Cas检测相比具有更好的检测效率（图3c,d），检测限为1 aM。为了比较该方法与RT-qPCR检测诺如病毒感染患者临床呕吐物样本的临床实用型和可靠性，对从江西省疾病预防控制中心采集的15份临床呕吐物样本进行检测。其中9份和6份样本检测为诺如病毒阳性和阴性（图3e），与RT-qPCR的检测结果完全一致（图3f），两种方法均未出现假阳性和假阴性结果，分析受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）表明，相对于RT-qPCR结果，CRISPRAIE的阳性预测一致性（9/9）和阴性预测一致性（6/6）均为100%（图3g）。![]()
图3 RT-RPA和CRISPRAIE的组合检测SARS-CoV-2 RNA到单拷贝水平
CRISPRAIE系统也可用于定量SARS-CoV-2 RNA，在不同靶标RNA之间具有通用性。将RT-RPA与CRISPRAIE联合用于检测SARS-CoV-2假病毒，检测限为1 copy/μL（图3a）。并对SARS-CoV、MERS-CoV、bat-SL-CoVZC45、hCoV-229E四种冠状病毒和人呼吸道病毒进行合成DNA模板检测，只有SARS-CoV-2
DNA模板存在能够显著提高荧光反应（图3b）。接着对75份鼻咽拭子样本进行检测，CRISPRAIE系统准确识别出Ct≤35的30个样本，灵敏度为100%，在35＜Ct≤38的20个样本中，CRISPRAIE系统成功检测出18个阳性样本，灵敏度90%，表明其在检测低病毒载量临床样本中的可靠性。在38＜Ct≤40的10个疑似样本中，CRISPRAIE系统检测出5个为阴性、另外为阳性，Ct＞40的样本则均被鉴定为阴性，表明该方法具有与标准RT-qPCR检测具有相当的灵敏度（图3c,d）。且ROC曲线显示，SARS-CoV-2
N基因的AUC为0.969（图3e）,证明其在对实际临床样本进行RNA定量的潜力。3. 使用AIEgens辅助SNA探针提高CRISPRAIE的灵敏度和稳定性
![]()
图4 AIEgen辅助SNA探针增强CRISPRAIE系统对复杂样品中靶标DNA检测
尽管CRISPRAIE系统中构建的Q-dsDNA/AIEgen-Q探针具有较好的稳定性和检测效率，在生物液体（如血清）中仍有核酸酶降解的风险，与纳米粒子的结合是提高线性核酸探针稳定性和灵敏度的一个重要途径。研究团队首先构建了一个SNA/AIEgen探针（图4a），并与CRISPR/Cas12a检测系统整合，检测合成的DNA靶标。基于SNA/AIEgen探针的改进CRISPRAIE系统检测限为55.7 fM（图4b,c），与Q-ssDNA-FAM和Q-dsDNA/AIEgen-Q探针相比，SNA/AIEgen探针在5 U/mL DNase和100%的胎牛血清存在下也有较好的稳定性和准确性（图4d-g）。接着他们比较了基于五种不同探针在CRISPR-Dx系统中的灵敏度，随着探针的进化，灵敏度也显著提高（图4h）。为了模拟从临床复杂样品基质中直接检测靶标，研究团队使用诺如病毒等多种合成DNA靶标添加到响应生物样品类型中，使用HUDSON方法处理后进行CRISPRAIE检测。基于Q-dsDNA/AIEgen- Q和SNA/AIEgen探针的CRISPRAIE检测在单独检测缓冲液和生物标本(如8%呕吐物、咽拭子、8%唾液或2.5%血清)中的所有靶标时，表现出显著增加的信号响应（图4i-n）。4. CRISPRAIE可以直接检测靶标RNA
![]()
图5 CRISPRAIE系统用于复杂样本中靶标RNA的检测
Cas13酶可以特异性识别RNA，因此将AIEgen荧光加入Cas13驱动的ssRNA切割反应中，开发了一种基于Cas13的CRISPRAIE实验，使用ssRNA连接子代替Q-dsDNA/AIEgen-Q和SNA/AIEgen探针中的ssDNA连接子（图5a-c），并于商业化合成的FAM探针比较，基于FAM探针的CRISPR-Dx系统只能检测到1 pM的RNA靶标（图5d）。当使用Q-dsDNA/AIEgens-Q和SNA/AIEgens作为探针时，CRISPRAIE检测分别响应100个和10个fM RNA靶标(图5e,f)。然后进一步利用该方法直接在诊断样本中进行测试，在含有8%呕吐物、8%咽拭子、8%唾液或2.5%血清的检测反应中均可检出SARS-CoV-2和埃博拉病毒（图5g-i）。
5. CRISPRAIE系统在POCT方面的应用
![]()
图6 适用于CRISPRAIE系统的便携式设备
研究团队开发了一个便携式的基于手机的CRISPRAIE检测平台，设备原型由主体部件、光学系统和电路系统组装而成（图6a）,该设备大约运行30min左右，并直接在手机显示结果（图6b）。图6c为该系统的工作流程，CRISPRAIE系统反应后，将试管放入样品罐,点击APP中的TEST按钮，测试结果直接上传到手机。该设备可以检测诺如病毒、埃博拉病毒和SARS-CoV-2三种不同的合成RNA靶标，浓度范围在10-15~10-10RNA之间（图6d-f）。同时他们将该设备与商用Multiskan GO多模读取器进行比较，两种检测模式之间具有高度线性相关性（图6g-j）。
