CRISPR生物传感器在核酸即时检测领域的应用及其信号输出系统的进展与挑战
文摘
科学
2024-07-12 10:58
浙江
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随着经济发展和社会进步，医疗模式和公共卫生观念发生了深刻变化。人民自我保护意识的增强和对个人健康的重视，提高了对体外诊断的现实要求。在当前时代，即时检测（POCT）已成为体外诊断的重要组成部分。值得注意的是，POCT系统依赖于有效的信号传导和输出方法，以简单易读的方式向终端用户呈现检测结果。生物酶和功能化纳米材料等信号传导组件，以及微流控芯片和便携设备等信号读取平台的进步，推动了各种便携信号输出方法的发展。规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关效应蛋白（Cas）通过其新颖的核酸切割活性为核酸检测开辟了一条新方向。尽管近年来报道了许多基于CRISPR系统的生物传感器，但相关核酸检测技术仍处于早期发展阶段，检测手段通常仍依赖于精密仪器和专业操作。而将便携式信号输出方法与CRISPR系统相结合，有望加速其在核酸POCT领域的发展和实际应用。近期，浙江大学化学工程与生物工程学院徐志南教授-黄迪助理研究员团队和浙江大学医学院方向明教授团队在TrAC
Trends in Analytical Chemistry期刊上发表题为“Advances and challenges of signal readout systems
in CRISPR-based biosensors for point-of-care testing of nucleic acid”的综述文章。该论文全面概述了CRISPR系统与便携式信号输出方法集成的重要原理、技术创新和典型应用，提出了该领域当前面临的挑战和后续发展的方向，并讨论了从信号输出的角度出发如何优化检测装置以满足核酸POCT的实际需求。![]()
图1. CRISPR生物传感器在核酸即时检测领域的应用及其信号输出系统
从WOS数据库中使用关键词“CRISPR”、“Nucleic acid”，“Detection/diagnosis”进行检索，截至2024年6月该领域已发表论文1082篇论文，其中与POCT紧密相关的有235篇。该综述对上述论文中使用的Cas核酸酶和信号输出方法进行了统计分析。主流的Cas核酸酶包括Cas9、Cas12和Cas13，它们表现出优异的靶标识别和体外切割能力。其中，Cas9能够在sgRNA的介导下特异性识别、切割dsDNA靶标。而Cas12和Cas13被称为“魔剪”，能够在crRNA的介导下识别靶标DNA或RNA，并依次激活特异性的cis切割活性和非特异性的trans切割活性。基于CRISPR系统的生物传感器，其独特之处便在于利用新颖的核酸酶活性来实现灵活的信号输出，能够根据不同检测场景调整进行相应调整。例如荧光信号、电信号、葡萄糖信号、颜色信号、距离信号是CRISPR
POCT中最热门的信号输出方式。其中，手持设备或仪器的信号读取在POCT中应用广泛，例如便携式蓝光成像仪、手持电化学工作站和家用血糖仪可用于获取难以直接观测的荧光信号、电信号和葡萄糖信号。归功于Cas核酸酶切割荧光探针实现了信号的放大，荧光信号输出以其高灵敏度和实时监控能力被广泛应用于CRISPR检测系统。研究人员还开发了基于纳米材料的荧光传感器，以降低背景信号和提高检测灵敏度。电化学信号读取具有成本低、便携性好和传输快速等优势。通过改进信号处理和分析模式，进一步提升检测灵敏度和时效性，电化学检测系统甚至有望在未来实现真正的免扩增核酸检测。家用血糖仪因其低成本和便捷性，已被改造用于非葡萄糖靶标的检测。CRISPR系统能够将核酸信号转换为葡萄糖信号，进一步扩展了其应用范围。研究人员还开发了集成式微流控芯片，以简化相关检测过程，实现更高效的一体化反应。![]()
图2. 基于荧光信号输出的CRISPR检测系统
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图3. 基于电信号输出的CRISPR检测系统
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图4. 基于葡萄糖信号输出的CRISPR检测系统
相较于依赖手持设备或仪器的信号输出方法，颜色和距离等裸眼可见的信号在直观性和便携性方面更具优势。在图像识别APP或标尺等设备的辅助下，这些方法也可以实现准确的定量检测。颜色信号可分为单色和多色信号，信号输出通常借助酶促反应或贵金属纳米粒子的局域表面等离子共振效应实现。常见应用包括金胶免疫层析试纸条和结合微流控技术的集成检测系统。而距离信号输出也主要依赖于微流控技术实现，通过可视长度和标尺进行目标物的定量分析。与颜色信号相比，距离信号读取更客观可靠，但其反应系统的复杂性在一定程度上限制了其在POCT领域的普及。![]()
图5. 基于单色信号输出的CRISPR检测系统
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图6. 基于多色信号输出的CRISPR检测系统
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图7. 基于距离信号输出的CRISPR检测系统
CRISPR技术正在逐步转化为适用于POCT的创新核酸检测工具，这得益于便携式信号输出方法。尽管这些方法在许多检测场景中展现了相应的优势，但要将其转化为可商业化的POCT装置仍面临诸多挑战。首先，现有CRISPR检测系统通常涉及多步反应过程，包括核酸扩增、靶标识别和信号放大等，这种分段检测模式可能导致气溶胶污染，从而影响检测的准确性。电化学传感系统与微流控技术的结合有望将多个反应步骤整合在微小的芯片内，在提高检测通量的同时，促进自动化模式的发展。其次，不同检测场景对灵敏度和准确性的要求各异，信号读取系统应具备灵活性以适应不同的POCT需求。而互联网远程医疗服务模式的兴起为CRISPR POCT系统提供了契机，特别是颜色或距离信号可通过智能手机识别，实现医疗数据的云端传输和存储，进而提升医疗效率。此外，多重POCT对于病原体检测至关重要，设计手持设备以准确读取荧光或电信号，并确保设备经济实用，是实现多重POCT的关键。最后，绿色理念在CRISPR POCT中同样重要，选择环保和无毒的信号输出反应，使用绿色化学品和材料，能够有效降低能耗、减少污染。综上所述，要满足现场采样、便携分析和快速反馈的实际需求，不仅需要设计便携的信号输出方法，更重要的是优化整体设备设计。通过有效整合样品预处理、目标分析物识别和信号处理等模块，来提供更全面和高效的POCT解决方案，确保其更好地符合不同场景下的实际需求。[1] Advances and challenges of signal readout systems
in CRISPR-based biosensors for point-of-care testing of nucleic acid. TrAC
Trends in Analytical Chemistry, 2024, DOI: 10.1016/j.trac.2024.117856.
