一种结合CRISPR和数字信号处理的现场核酸检测技术
文摘
科学
2024-09-06 12:37
浙江
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在临床诊断、健康监测以及其它生物技术应用中，快速灵敏地检测特定RNA序列非常重要。例如基于SARS-CoV-2的RNA检测被认为是其临床诊断的金标准。目前，广泛使用的RNA检测技术主要依赖于逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），因为它具有高灵敏度和特异性。然而，RT-PCR需要精密的热循环设备，通常还需要荧光检测，这并不符合即时诊断的要求。作为RT-PCR方法的有吸引力的替代方案，等温扩增策略（例如重组酶聚合酶扩增和环介导等温扩增）已被开发并应用于RNA的定量检测。这些等温扩增技术不需要热循环仪器，并且可以轻松地与成簇的规则间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白（CRISPR/Cas）系统集成。这些集成方法的主要优点是由于核酸的指数扩增和CRISPR/Cas系统提供的高特异性而具有高灵敏度。但是这些集成方法通常需要多种酶、引物和探针，增加了检测成本。CRISPR/Cas13系统反式切割活性的发现激发了人们对开发无需逆转录或核酸扩增的直接RNA检测技术的兴趣。然而，这些无需扩增的方法的检测限通常在pM水平，不能满足大多数临床样本的检测要求。级联CRISPR/Cas系统虽然将直接RNA分析的检测限提高到fM水平，但额外引入另一个CRISPR/Cas系统或多个crRNA，增加了分析成本和设计的复杂性。另外，大多数此类检测需要光学（例如荧光）或电化学检测设备。基于以上背景，北京科技大学化学与生物工程学院李正平团队联合加拿大阿尔伯塔大学开发了一种既不需要核酸扩增，也不依赖于光学或电化学检测设备检测RNA的方法，仅仅利用了CRISPR/Cas13a的反式裂解活性和RNA-桥接DNA水凝胶的特性。研究人员首先制备RNA桥接DNA水凝胶，并将其引入毛细管形成一层薄膜。当crRNA引导的CRISPR/Cas13a与目标RNA结合时，其反式裂解活性被激活，导致水凝胶膜中的RNA桥被裂解，进而增加水凝胶的渗透性，水凝胶渗透性的变化使得样品溶液在毛细管内行进的距离发生相应变化，通过测量样品溶液在毛细管内移动的距离，就可以定量读取样品中RNA的含量，无需扩增或者任何光学或电子设备。1. RNA桥接DNA水凝胶毛细管传感器检测RNA原理
研究人员利用寡核苷酸交联策略制备了CRISPR/Cas13a响应和RNA桥接DNA水凝胶。如图1A所示，首先制备两条丙烯酰胺修饰的DNA链（A-DNA-X和A-DNA-Y），分别与丙烯酰胺单体共聚成直链聚丙烯酰胺-DNA、PA-X和PA-Y。设计的双作用交联单链RNA（DRCL-ssRNA）包含三个序列区：3’端和5’端的两个序列分别与DNA-X和DNA-Y互补，中间的富U基序则是Cas13a反式裂解的底物。DRCLssRNA两端与DNA-X和DNA-Y链杂交后形成了DNA水凝胶，在室温下具有多孔结构。DRCL-ssRNA中间的富UDRCL-ssRNA可被活性CRISPR/Cas13a裂解，DRCL-ssRNA的裂解增加了水凝胶的渗透性。CRISPR/Cas13a系统的激活是通过靶RNA与crRNA-Cas13a核糖核蛋白（RNP）的特异性相互作用实现的。一旦被RNA靶标激活，CRISPR/Cas13a系统就会同时具有顺式切割（靶标特异性）和反式切割(侧向切割)功能。研究团队利用了靶标RNA激活CRISPR/Cas13a系统的反式切割活性，每个靶标激活的CRISPR/Cas13a都会切割水凝胶中的多个RNA桥序列，从而破坏DNA-X和DNA-Y之间的交联并增加DNA水凝胶的通透性(图1A)。不同浓度的靶RNA会激活不同量的CRISPR/Cas13a酶来切割RNA桥，从而导致水凝胶的通透性不同。由于反应溶液在毛细管中行进的距离取决于水凝胶的通透性，因此可以通过该距离估算出反应溶液中靶标的含量。![]()
图1
2. CRISPR/Cas13a响应和RNA桥接DNA水凝胶毛细管传感器的可行性验证
研究团队测试SARS-CoV-2核衣壳（N基因）的两个片段和两个N基因特异性crRNA（crRNA1和crRNA2），以识别相应的靶序列。分别使用crRNA1和crRNA2形成crRNA-Cas13a核糖核蛋白，加入靶N基因后激活crRNA-Cas13a核糖核蛋白反式切割活性，荧光探针(FAMUUUUUC-BHQ1)被裂解，qPCR仪监测荧光信号变化，结果显示显示crRNA1和crRNA2的表现相似（图2A、B），均可用于后续实验。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析结果证实，SARS-CoV-2的靶N基因激活了CRISPR/Cas13a系统来反式切割DRCL-ssRNA序列（图2C）。研究团队接着将RNA桥接的DNA水凝胶填入毛细管中，当靶N基因激活CRISPR/Cas13a系统切割DRCLssRNA序列时，水凝胶中的“桥梁”断裂从而增加了水凝胶的渗透性。因此，在SARS-CoV-2的靶N基因存在下，所得反应溶液在CRISPR/Cas13a响应水凝胶毛细管中迁移至40 mm（图2D），而当反应溶液不含有靶N基因时，迁移最小（<3 mm）。毛细管中的迁移距离非常直观，证明了CRISPR/Cas13a响应水凝胶毛细管传感器用于无扩增和视觉检测特定核酸序列的可行性。![]()
图2
3. CRISPR/Cas13a响应和RNA桥接DNA水凝胶毛细管传感器灵敏度研究
研究团队在最佳实验条件下评估了CRISPR/Cas13a响应的RNA桥接水凝胶毛细管传感器用于可视化检测SARS-CoV-2RNA的特定N基因序列。肉眼观察结果（图3A）显示，随着目标RNA浓度从100 fM（约60拷贝/μL）减少到100aM（约60拷贝/μL），毛细管中溶液行进的距离成比例减少。100 aM靶标（1.2 cm）与阴性对照（0.5 cm）之间的行进距离差异很容易区分。样品溶液在毛细管中行进的距离（D）与100 aM至100 fM范围内靶标RNA浓度的对数呈线性相关（图3B）。相关方程为D=38.75+2.35lgCRNA，相关系数为0.9960，表明该传感器可以提供定量结果。此外，图3C结果显示该传感器可以特异性地检测SARS-CoV-2的N基因，而与其他SARS样冠状病毒的相关N基因没有交叉反应，包括蝙蝠SARS样冠状病毒ZC45（bat-SLCOVZC45），SARS冠状病毒（SARS-CoV）和人类冠状病毒HKU1（Human-COV-HKU1）。![]()
图3
与之前报道的基于宏观形状变化的DNA水凝胶传感器相比，CRISPR/Cas13a响应的RNA桥接DNA水凝胶毛细管传感器的灵敏度提高有两个重要的独特之处。首先，一旦CRISPR/Cas13a被单个目标分子激活，活性CRISPR/Cas13a的反向裂解活性就会发生多次周转（kcat~2 s-1），从而导致水凝胶中的多个RNA桥被裂解，在水凝胶的小体积内破坏多个RNA桥会大大增加其渗透性。因此，只需少量目标物就能激活反式裂解活性，就可使水凝胶的渗透性发生显著变化。其次，底物（RNA桥）的局部浓度较高，这改善了酶与底物的反应。与使用CRISPR/Cas13a的典型荧光检测法相比，这两个特点都大大提高了分析灵敏度，缩短了检测时间。由于灵敏度显著提高，CRISPR/Cas13a反应性RNA桥接水凝胶毛细管传感器可以检测100 aM的靶标（约60 拷贝/μL），且该检测方法无需核酸扩增，具有足够的灵敏度。通常，SARS-CoV-2 RNA临床样本的浓度通常为约103-106拷贝/μL，因此可直接测定。与之前报道的无扩增CRISPR/Cas13平台（非定量或需要检测仪器）相比，该团队开发的毛细管传感器可以使用肉眼进行定量测量，而无需依赖任何光学或电气设备。这些特点表明，它符合即时诊断的要求。4. 使用CRISPR/Cas13a响应水凝胶毛细管传感器分析鼻咽拭子和唾液样本
为了评估CRISPR/Cas13a响应水凝胶毛细管传感器的实际应用，研究团队分析了临床鼻咽（NP）拭子。研究团队从10份确诊为SARS-CoV-2阳性的鼻咽拭子样本和6份阴性的鼻咽拭子样本中提取了病毒RNA，分别使用CRISPR/Cas13a响应水凝胶毛细管传感器和RT-PCR对16份NP样品进行检测，其结果如图4B，与阴性样本和空白对照相比，所有SARS-CoV-2感染者的阳性样本都能在毛细管中产生可测量的移动距离。和标准RT-PCR结果相比，CRISPR/Cas13a响应水凝胶毛细管传感器得出的定量结果一致（图4C）。![]()
图4
研究团队还将CRISPR/Cas13a响应水凝胶毛细管传感器应用于检测唾液样本中的SARS-CoV-2RNA。研究团队分析了10个热处理唾液样本，其中包括来自确诊SARSCoV-2感染患者的5个样本（唾液1-5）和来自健康个体的5个样本（唾液6-10）。结果如图4D所示，与阴性唾液样本和空白对照相比，所有SARS-CoV-2阳性唾液样本溶液在毛细管中都产生了显著的行进距离。以上结果表明，该团队所开发的CRISPR/Cas13a响应水凝胶毛细管传感器能够灵敏、特异地检测特定的病毒RNA，且无需任何光学或电化学测量设备即可获得定量结果。根据校准和相关性（图3B），研究团队估算出了被测NP样品中病毒RNA（N基因）的拷贝数，其范围从40拷贝/μL到16720拷贝/μL。
研究团队制备了一种CRISPR/Cas13a响应和RNA桥接DNA水凝胶毛细管传感器，可用于快速便携地检测特定RNA。水凝胶传感器制备简单，将RNA交联的DNA水凝胶薄膜放置在毛细管末端即可完成。当CRISPR/Cas13a识别到目标RNA时，反式裂解活性会裂解水凝胶中的“RNA桥”，增加水凝胶的渗透性，导致不同距离的移动。通过目视读取距离即可定量检测目标RNA，无需核酸扩增或辅助设备，并且该技术已成功用于检测SARS-CoV-2 RNA样本。由于无需光学或电化学检测设备，该方法适用于及时核酸检测，具有高灵敏度和经济性。
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[1] CRISPR/Cas13a-Responsive and RNA-Bridged
DNA Hydrogel Capillary Sensor for Point-of-Care Detection of RNA. Analytical Chemistry,
2024, 96(29): 12022-12029.
