DNA荧光编码(FLUCO)实现51色生物成像分析
文摘
科学
2024-07-19 10:46
浙江
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颜色编码在绘图、数字摄影、光谱分析等领域发挥着至关重要的作用。在分子水平上实现精确的、靶标响应的颜色编码有望在组学分析、信息存储和分子索引等革命性领域发挥重要作用。DNA易于合成且具有信息存储能力及可编程性，是实现精确控制颜色编码的关键基础。目前，已经有各种基于DNA的颜色编码方法，如序列编码扩增子、变色荧光条形码、DNA折纸技术等。然而，这些方法不能将靶标响应信号放大和精确可控的颜色编码能力相结合。针对这一问题，同济大学医学院朱小立教授、孙奋勇教授、李文星博士团队开发了一个基于计算机辅助设计（CAD）的多位DNA自组装技术FLUCO。该技术可以精确编码51种颜色，能够使用传统的成像设备对超出通道限制的多个靶标同时成像，在空间蛋白质组学成像和多靶标分析等领域具有巨大的应用潜力。相关成果以“DNA-Programmed Four-Bit
Quaternary Fluorescence Encoding (FLUCO) Enables 51-Colored Bioimaging Analysis”为题发表在国际权威杂志Journal of the American Chemical Society上。作者首先将HCR系统的设计规则转换为计算机语言，并开发了交互式设计程序，取代人工设计，从而有效解决高正交多路复用HCR系统设计过程中保持个体响应性的同时有效最小化非特异性序列交互的难题，HCR系统的设计过程如图1a所示。作者首先将HCR的DNA序列根据其功能分为环区(Loop)和茎区(Stem)，随后对序列长度、G/C含量以及序列相似性进行理论设计，以DNA碱基A/T/C/G为字节，基于CAD构建了两个序列相互作用/干扰高度可控的DNA序列数据库，包括一个7字节的环数据库和一个16字节的茎数据库(图1b)。对于环区，其序列长度为7 nt，包括3个G/C字节，序列相似性不超过4 nt (57.1 %)。对于茎区，其序列长度则为16 nt，包括8个G/C字节，序列相似性不超过6 nt (37.5 %)。随机选取序列数据库中的DNA片段，组合形成HCR元件。作者在传统双发夹HCR(dHCR)的基础上提出了四发夹HCR (qHCR)、六发夹HCR (hHCR)和八发夹HCR (oHCR)等先进的DNA自组装策略。如图1c，琼脂糖凝胶电泳结果表明dHCR、qHCR、hHCR和oHCR可成功实现。为解决多组HCR共享一个或多个环序列而导致的非特异性问题，作者设计了三组共享4个环序列的qHCR（图1d）进行实验验证。理论分析、热力学分析以及琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜实验(图1e-g )表明多组HCR系统之间相互干扰极小，无非特异性问题。![]()
图1 多位DNA自组装系统的构建
接下来，作者将构建的HCR系统用于FLUCO。如图2a-d，对于传统的dHCR，当只有一种荧光基团时，一元FLUCO只能编码1个条形码。随着荧光基团的增加，含有两个荧光基团的二元FLUCO可以编码3个条形码，含有三个荧光基团的三元FLUCO可以编码6个条形码。当荧光基团数目增加到4时，四元FLUCO则可以编码10个条形码。为了获得更多的条形码，可以选择进一步增加荧光基团的数量或者增加编码位数。然而，由于荧光光谱重叠的问题，研究人员无法区分更多类型的荧光基团。相比之下，开发诸如qHCR等自组装体系来增加编码位数是一种更可行的替代方案。如图2e-f，基于qHCR的一元、二元、三元和四元FLUCO分别可以编码1、7、22和51个条形码并显示出可区分的颜色编码效果。上述结果表明，基于dHCR和qHCR的多元FLUCO可以打破荧光通道的限制。与dHCR系统相比，qHCR系统表现出强大的容量扩展性能，能够满足大多数应用的需求。![]()
图2 多元FLUCO系统的构建
然而，在荧光显微成像的结果中部分FLUCO的结果很难用肉眼分辨。基于此，作者提出了针对FLUCO的解码技术。如图3a，以四位四元FLUCO为例，解码过程包括荧光组成的确定和荧光比例的确定两步。单色编码(G、Y、R、B)和四色编码(G1Y1R1B1)具有独特的条码形式，因此通过阈值过滤确定荧光基团组成即可进行区分(图3b)。然而，对于双色编码和三色编码，则需要增加一步荧光比例的判读。具体来说，从G、R、Y、B四种颜色中选取双色编码组合，共有6种可能性，即GR、GY、GB、RY、RB、YB。此外，四位编码中的每个双色编码组合荧光比例可能为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，故总共可产生30种条形码。类似地，三色编码共4种组合，即GRY，GRB，GYB和RYB。而每个三色编码组合的荧光比例又有1:1:1、2:1:1、1:2:1和1:1:2四种可能性，因此总共可产生16种FLUCO条形码(图3c )。综上所述，通过对荧光组成和荧光比例的判读可成功实现对51种条形码的精确解读。针对人工信号解码在面对海量数据时的局限性，作者进一步验证了计算机视觉辅助信号解码的可行性。如图3d所示，计算机视觉辅助信号解码遵循与人工信号解码类似的步骤。然而，不同之处在于计算机视觉分析的能力允许更精确的参数设置，通过对荧光亮度、尺寸和面积的筛选可自动滤除背景信号，从而避免对非特异信号的统计分析。以上结果表明，基于qHCR的四位四元FLUCO的编码与解码均具有可行性，有望在多重靶标分析中发挥重要价值。![]()
图3 四位四元FLUCO的信号解码
随后，作者将FLUCO应用于多路液体活检。如图4a-b所示，FLUCO中各荧光强度随时间呈正比例增加，证明FLUCO的准确性仅依赖于qHCR序列的设计，而非qHCR序列的组装时间或组装程度。HCR反应1.5 h后荧光强度不再增加，作者选择该时间作为后续实验的反应时间，可忽略HCR产物长度的变化对信号解码的影响。作者使用磁珠捕获检测靶标miRNA的转录产物cDNA，cDNA触发相应的qHCR反应并得到预期的FLUCO结果。如图4c-d，荧光强度与靶标浓度高度线性相关，检测线性范围为500 pM ~ 25 nM，对应100 pM ~ 5 nM cDNA。为进一步提高检测灵敏度，作者将磁珠数量减少10倍以增加单个磁珠对靶标分子的捕获，并增加曝光时间和激光强度以增强荧光信号，成功检测到1 pM的靶标分子。接着，作者对7个miRNA进行了一锅检测。如图e-g，一锅检测体系可特异性的检测每个靶标miRNA，7组检测系统无交叉反应。此外，作者还将miRNA转录产物cDNA加入不同浓度的胎牛血清中进行检测。结果表明，FLUCO检测体系可稳定输出检测信号，证明FLUCO系统在复杂液体活检系统中具有强大的抗干扰能力。![]()
图4 基于FLUCO的多路液体活检
最后，作者将FLUCO系统应用于溶液中蛋白质的检测。如图5a所示，作者在磁珠表面修饰蛋白质抗体，捕获靶标蛋白后，靶标蛋白进一步与标记有I链的抗体结合。随后，在体系中加入HCR系统的发夹DNA，I链启动HCR反应并输出相应的荧光信号。如图5b，作者设计了9组qHCR序列，所有qHCR均表现出良好的功能性和高度正交性。图5c证明，经修饰的抗体对蛋白质靶标的免疫识别活性未发生明显变化，且qHCR的荧光信号放大倍数比免疫荧光高约3倍，证明qHCR在低丰度蛋白靶标分析中具有优势。接着，作者将9个对应于不同细胞器的模型蛋白编码为9个不同的信号：Ezrin = Y，Actin = R，Lamin A = B，Histone H3 = Y1R1B1，FBLR = Y1R1B1G1，COXiv = G1Y1，GM130 = G1B1，LC3B = G1R1，LAMP1 = R1B1。在四个荧光通道中成像后，叠加图像，随后进行荧光信号分离，最终成功获得单个细胞内9个细胞器的空间定位信息(图5d )。![]()
图5 基于FLUCO的细胞内蛋白多重成像分析
同济大学医学院朱小立教授、孙奋勇教授、李文星博士团队开发了一个基于计算机辅助设计（CAD）的多位DNA自组装技术FLUCO，实现了靶标响应信号放大和精确可控颜色编码能力的结合。该技术可以精确编码51种颜色，打破荧光通道的限制，提高了检测通量。通过进一步增加编码位数和荧光基团数，可进一步扩大其通量。此外，作者用计算机辅助序列设计取代传统的手工序列设计，并开发计算机视觉辅助信号解码技术，使FLUCO允许可定制、智能及自动的编码设计和解码过程，有效地解决了人工编码和解码分析耗时耗力的问题。作者成功将FLUCO技术应用于核酸和蛋白靶标的液体活检，并验证了该技术在单细胞内多蛋白靶标原位空间成像中的应用和实现潜力。通过改变靶标类型，FLUCO技术有望成为脱落细胞分析、转录组分析、RNA表观遗传学分析等应用的有力工具。
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[1] DNA-Programmed Four-Bit Quaternary Fluorescence
Encoding (FLUCO) Enables 51-colored Bioimaging Analysis. J. Am. Chem. Soc., 2024,
146, 16428-16439.
