一种基于核酸适配体、RCA扩增和脲酶介导石蕊试验的比色生物传感平台
文摘
科学
2024-05-24 09:59
浙江
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高灵敏度和易于使用的生物传感器非常适于即时诊断。然而，传统的生物传感器仅由一个识别元件和一个转导元件组成，当仅存在极低浓度的疾病生物标志物时，传统生物传感器通常不够灵敏。因此，研究人员致力于将信号放大元件结合到生物传感器中以提高检测灵敏度。滚环扩增（RCA）以环状DNA为模板，通过一个短链DNA引物（与部分环状模板互补），在Phi29 DNA聚合酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段，可以实现对靶核酸的信号放大。脲酶可以催化尿素水解，产生二氧化碳和氨，该反应可以提高溶液的pH值，从而可介导酸碱指示剂颜色变化。麦克马斯特大学李应福团队开发了一种基于适配体、RCA和脲酶的比色生物传感平台，可通过肉眼观察检测结果。使用该平台在1 h内成功检测到低浓度的凝血酶、PDGF和人类唾液样本中的SARS-CoV-2，具有临床应用潜力。相关成果以“A Colorimetric Biosensing
Platform with Aptamers, Rolling Circle Amplification and Urease-Mediated Litmus
Test”为题发表在国际权威杂志Angewandte Chemie International
Edition上。
基于RCA-脲酶的比色生物传感平台基本原理如图1所示。5’生物素标记的DNA引物(BP)与环状DNA模板(CT)杂交，在Phi29 DNA聚合酶(DP)和dNTPs存在下启动RCA反应。混合液中同时还加入了修饰有脲酶的单链DNA (UrD)，UrD序列与RCA产物部分序列互补，且其3’端标记有反转T，可阻止DNA聚合酶对其延伸和降解。RCA产物中含有数百个串联重复序列，故可结合多个UrD。RCA反应结束后，向反应溶液中加入修饰有链霉亲和素的磁珠(MB)，通过链霉亲和素-生物素相互作用分离RCA产物并洗去游离的UrD。随后，向反应体系中加入尿素，脲酶水解尿素使溶液pH发生变化，从而在酸碱指示剂存在的情况下介导溶液颜色由黄色变为红色。![]()
图1 基于RCA-脲酶的比色生物传感平台反应原理
为验证上述实验设计，作者对RCA产物进行了脲酶介导的比色实验，如图2所示。dPAGE分析表明，无论是否存在UrD，BP与CT孵育后均可产生大量的RCA产物。经过磁分离和洗涤步骤后，含有RCA产物和UrD的样品发生了明显的颜色变化，而没有RCA产物或脲酶的反应混合物的颜色保持不变。上述结果表明，脲酶介导的比色反应可用于RCA产物的裸眼检测。![]()
图2 基于RCA-脲酶的比色生物传感平台实验验证
RPM：RCA产物单体；LCD：上样内参DNA
为提高生物传感平台的性能，作者首先考察了将UrD加入反应体系的最佳时机。研究表明，大量RCA产物可诱导磁珠的聚集。若在扩增后加入UrD，UrD与聚集的RCA产物之间的杂交效率会显著降低。因此，作者选择在RCA反应中引入UrD。另外，为降低背景信号、提高检测灵敏度并缩短反应时间，作者使用5 %的脱脂奶粉作为磁珠表面的封闭试剂，并优化反应条件为初始pH为6.0，反应体积为50 μL。随后，作者对该生物传感平台的检测灵敏度进行评估。如图3所示，200 pM RPM(RCA产物单体，即CT互补链)和2 pM RP(RCA产物，即经RCA扩增产生的串联链)在反应15 min后出现明显的颜色变化。反应60 min后，RPM的检测限降至20 pM，RP的检测限降至0.2 pM。上述结果表明，RCA反应可将比色反应的检测灵敏度提高2个数量级。此外，作者还使用光谱分析（570 nm和443 nm处吸光度的比值A570 / A443）验证了该比色传感平台的检测灵敏度。光谱分析检测灵敏度与上述裸眼观察灵敏度一致。![]()
图3 基于RCA-脲酶的比色生物传感平台的检测灵敏度
如图4所示，为实现对凝血酶的检测，作者使用还原氧化石墨烯(rGO)作为转导介质，将抗凝血酶DNA适配体通过物理吸附的方式附着在rGO表面。当样本中存在凝血酶时，凝血酶与适配体相互作用并使其构象发生变化，从而使其从rGO表面释放。随后，释放的适配体作为引物启动RCA反应。利用该方法可通过裸眼观察或光谱分析成功检测到50 pM凝血酶，结果表明该检测平台可足够灵敏地监测人体血液中的凝血酶(nM水平)。以PDGF和BSA为反应底物的对照实验组无显著颜色变化，表明该方法具有较高的特异性。![]()
图4 基于RCA-脲酶的比色生物传感平台对凝血酶的检测
随后，作者将该比色生物传感平台应用于PDGF检测。PDGF是一种在血管形成中起重要作用的生长因子，在人类恶性肿瘤中过量表达，是潜在的癌症诊断生物标志物。如图5a所示，为检测PDGF，作者设计了一种功能性发夹探针(HP)，其5’端含有抗PDGF适配体序列，环形区域为RCA的引物序列，3’端为与5’端序列互补的封闭序列。Phi29 DNA聚合酶可以从3’端消化单链DNA。当PDGF存在时，HP结构发生变化，暴露出其3’端。Phi29 DNA聚合酶剪切HP 3’端暴露出的单链DNA，将HP转化为成熟的引物，进而起始RCA反应并实现对PDGF的检测。为验证该实验方案的可行性，作者首先评估了存在PDGF和不存在PDGF的情况下HP的消化情况。如图5b所示，在没有PDGF时未观察到消化产物，而当存在PDGF时，体系中产生了大量的消化产物，证明HP的消化是PDGF依赖性的。随后，作者对反应体系进行优化。为提高信背比，作者在加入CT前用Phi29 DNA聚合酶和dNTPs预处理HP (20 nM) 15 min以去除错误折叠而无法启动RCA的HP分子并选择30℃作为PDGF与适配体反应促使HP结构变化的最适温度。进一步实验表明无论是否加入UrD，将HP和CT与PDGF共孵育后都可产生大量的RCA产物。体系中存在UrD并加入尿素后，反应体系可产生明显的颜色变化。结果表明，使用基于RCA-脲酶的比色生物传感平台可实现对PDGF的检测。随后，作者对该比色传感平台检测PDGF的灵敏度和特异性进行评估。如图6所示，该方法反应1 h后可检测到浓度低至5 pM的PDGF，以凝血酶和BSA作为底物的对照实验组均未产生明显的颜色变化，该方法具有较高的特异性。此外，作者通过实验验证该方法能够在20 %的尿液中检测到低至5 pM的PDGF。健康人体尿液中PDGF的浓度通常在46 ~ 110 pM范围内，而癌症患者尿液中PDGF的浓度更高。因此，该方法具有临床检测PDGF的潜能。![]()
图5 基于RCA-脲酶的比色生物传感平台对PDGF的检测原理和实验验证
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图6 基于RCA-脲酶的比色生物传感平台对PDGF的检测灵敏度和特异性
此外，作者还将该比色传感平台应用于人类唾液中SARS-CoV-2的检测。以SARS-CoV-2的刺突蛋白( S蛋白)为检测靶标，作者设计了与S蛋白同样具有3重对称性的同源三聚体DNA适配体TMSA52，该适配体可与S蛋白进行三价识别，从而可以非常高的亲和力结合不同的S蛋白变体。如图7a，作者使用TMSA52的两个变体即固定在链霉亲和素修饰的磁珠上的标记有生物素的TMSA52 ( TMSA52-B )和包含引物的TMSA52 ( TMSA52-P )与病毒形成三明治结构，起始后续基于RCA-脲酶的比色实验。如图7b,c所示，该反应可在1 h内裸眼观察到3.2×103 cp/mL的假病毒，且只有体系中存在SARS-CoV-2假病毒时才可产生明显的颜色变化，具有较高特异性。为了评估该反应的临床实用性，作者检测了77例患者唾液样本，其中包括37例阳性样本和40例阴性样本。在37份阳性样品中，31份样品在比色实验中产生了明显的颜色变化(图8a中标注为' + ')，40份阴性样品均未产生颜色变化，该反应检测实际样本的灵敏度为83.8 % (真阳性率)，特异性为100 % (真阴性率)。光谱分析和RT-PCR检测结果表明，该比色平台对临床样本检测结果与RT-PCR具有良好的一致性。![]()
图7 基于RCA-脲酶的比色反应对SARS-CoV-2的检测
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图8 基于RCA-脲酶的比色反应对临床唾液样本中SARS-CoV-2的检测
最后，作者将RCA-脲酶比色传感平台集成到纸基设备中。首先，作者将5’生物素标记的DNA引物( BP2 ) -链霉亲和素缀合物固定在硝酸纤维素表面。接着，向其中加入封闭剂( 5 %脱脂奶粉)以防止蛋白质(如脲酶)与纸张表面的非特异性结合。随后，作者将CT、Phi29 DNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液和UrD的混合物加入纸基设备以进行RCA，室温孵育60 min后洗涤去除游离的UrD并进行比色实验。为降低背景信号，作者优化UrD浓度为10 nM。如图9所示，基于RCA-脲酶的比色反应可成功在纸基设备上进行。为了实现对DNA检测，作者将3’生物素标记的DNA捕获序列( DC )固定在纸张表面，用于捕获DNA靶标( DT )。如图10a所示，DT包含2个序列结构域，分别是与DC结合的5’结构域和作为RCA引物的3’结构域。因此，DT可以启动RCA反应，使纸张上生成固定化的RCA产物。随后，通过结合在RCA产物上的UrD和尿素相互作用，纸张颜色发生显著变化。使用该方法可在20 min内肉眼观察到100 pM的靶标DNA。通过Image J对显色结果进行分析，检测限可进一步提高至10 pM。![]()
图9 RCA-脲酶介导的比色反应集成到纸基设备中
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图10纸基 RCA-脲酶比色传感平台检测DNA
麦克马斯特大学李应福教授团队开发了一种基于适配体、RCA和脲酶的比色生物传感平台，该平台可在1 h内成功检测到低浓度的凝血酶、PDGF和人类唾液样本中的SARS-CoV-2，裸眼即可观察检测结果。此外，该比色传感器可集成到纸基设备中，成本较低，简单便携，有利于用于POCT检测。这种方法可以将对靶标具有相对低亲和力的适配体转化为超灵敏的比色生物传感系统。并且，通过整合用于不同目标识别的适配体，该平台可扩展至其它多种靶标的比色检测。[1] A Colorimetric Biosensing Platform with Aptamers, Rolling Circle Amplification
and Urease-Mediated Litmus Test. Angew. Chem. Int. Ed., 2023, 62, e202315185.
