变构核酶与CRISPR-Cas12a融合用于小分子靶标的高效诊断
文摘
科学
2024-11-01 10:55
浙江
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在过去的十年中，自然进化的CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）Cas（CRISPR相关）系统已被采用为强大的分子工具，不仅用于遗传操作，还用于即时诊断。其中，2类CRISPR-Cas系统，包括II型（以Cas9为代表）、V型（以Cas12为代表）和VI型（以Cas13为代表），因其具有独特的可编程单效应核酸酶而备受关注。此功能已被用于创建新技术，例如基于Cas12a的DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）和基于Cas13a的SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）用于核酸检测。以Cas12a为例，在通过可编程crRNA（CRISPR-RNAs）以PAM依赖性（dsDNA）或PAM非依赖性（ssDNA）方式结合特定靶标DNA底物后，Cas12a的RuvC核酸酶结构域被激活，分别导致靶标DNA底物和非靶标DNA链的位点特异性和非特异性切割（图1a）。一般DNase的这种附带活性可以通过消化荧光报告探针将特异性靶点识别转化为大量扩增的信号，从而高度保证了检测的灵敏度和便利性。![]()
图1 用于靶标检测的工程CRISPR-Cas12a系统示意图
除了核酸外，还有一系列非核酸靶标，包括离子、小分子、大分子、囊泡等，这些靶标对生命科学非常重要，但缺乏有效的检测方法。用于诊断应用的CRISPR技术的最新进展表明，通过将非核酸传感元件与CRISPR-Cas12a三元复合物（即激活剂DNA、crRNA和Cas12a蛋白）混合，将这些元件对靶标的识别转导到激活剂DNA的识别，可以衍生出CRISPR系统来灵敏地检测不同的小分子和离子。这种信号转导主要是基于非核酸靶标的竞争性结合来释放或捕获激活剂DNA，这一任务已被证明可以通过变构转录因子（aTF）和适配体等分子传感器来完成。尽管这些传感器在转换信号方面取得了成功，但可用aTF的数量有限，阻碍了这种策略的更广泛应用。此外，竞争性结合需要一定的亲和力作为保证，这也不利于那些只与传感器弱相互作用的靶标。除了基于竞争性结合的策略外，靶依赖性RNA切割DNA酶是转导输入信号的另一种方式，但只有少数研究对其进行了讨论。复旦大学顾宏周团队过将配体依赖性变构核酶与CRISPR-Cas12a融合，创建了衍生的CRISPR-Cas系统，用于在1-2小时内对非核酸靶标进行高效定量分析。在两种不同的小分子上，证明了该系统的通用性、可靠性和准确性，并表明该系统的良好可操作性可以实现血液样本中小分子的高通量检测。相关成果以“Fusing
Allosteric Ribozymes with CRISPR-Cas12a for Efficient Diagnostics of Small
Molecule Targets”为题发表在Small Method杂志上（DOI：10.1002/smtd.202401236）1. 变构核酶CRISPR-Cas12a（ARC）系统概述
之前的研究已经产生了许多可以由配体分子特异性触发的变构核酶。这些变构核酶通常由RNA适体（绿色）、锤头核酶（蓝色）和桥接两者的通信模块（紫色）组成（图1b）。在适配体结构域识别配体后，发生构象变化，通过通信模块转导，最终激活锤头核酶进行位点特异性自切割。团队的计划是利用锤头切割从变构核酶中释放crRNA序列，从而实现随后的RNA引导CRISPR-Cas12a扩增。这种设计要求在核酶切割之前或在没有配体的情况下，crRNA序列被变构核酶的存在阻断，使得Cas12a缺乏酶激活的向导RNA。有研究表明在crRNA的3'端添加冗余核苷酸会显著削弱Cas12a的一般DNase活性。基于此，团队选择将crRNA的3'端与变构核酶的5'端融合，以期将Cas12a的活性阻断（图1b）。由于锤头核酶具有循环渗透性，原则上，对于长单链锤头，其5'端可以存在于三个茎中的任何一个（茎I-III）。在此，茎II已经被设计为与适配体结构域连接的通信模块，只留下茎I和III可编辑。最终，团队选择将crRNA序列融合到茎III的5'端，因为只有这样的融合才能在配体诱导的变构核酶切割后产生完整的crRNA。完整的crRNA没有阻塞性3'端，引导Cas12a识别和切割靶dsDNA底物，从而间接激活Cas12a的反式切割DNase活性。然后消化用荧光团-淬灭基团修饰的ssDNA报告分子，从而产生可测量的荧光信号。考虑到典型的变构核酶和Cas12a都能在几分钟内催化反应几乎完成，估计整个样品到结果的时间约为1-2小时。2. ARC系统的实验验证
为了评估这种衍生的CRISPR-Cas12a系统的性能，团队使用了一种变构核酶，该核酶可以特异性地响应c-di-GMP（环二胍基-5'-单磷酸），这是一种由由两个鸟苷三磷酸通过二胍环化酶合成的小分子（图2a），并作为重要的细菌第二信使调节许多生理过程。这种变构核酶由137个核苷酸（nt）组成（命名为CDG-AR137），具有可区分的适配体、通信模块（桥）和锤头核酶三个结构域（图2b）。通过合理设计，将一个41nt的crRNA序列的3'端与其核酶茎III的5'端融合，使得c-di-GMP诱导的RNA切割可以释放出这个41nt的crRNA。同时，我们还用一个环封闭了茎I的3'和5'端，这使得重新设计的变构核酶成为一种165nt长的ssRNA（命名为CDG-AR165）。通过体外转录的RNA，证实了41nt crRNA能够引导Cas12a消化DNA探针，而CDG-AR165构建体很好地阻断了Cas12a的活性。然后，团队开始检查CDG-AR165─CRISPR-Cas12a系统是否可以准确感应c-di-GMP（图2c）。团队通过使用dPAGE分析不同c-di-GMP浓度下诱导的核酶切割（图2d），比较了CDG-AR165和CDG-AR137的敏感性。剂量反应曲线产生EC50的值分别是CDG-AR137为311.1
nM，CDG-AR165为318.5
nM（图2e），表明crRNA融合对这种变构核酶的敏感性没有影响。接下来，团队在Cas12a、激活剂DNA和ssDNA探针的存在下，监测了一系列不同浓度的c-di-GMP与CDG-AR165一起孵育时的荧光信号（图2f）。在30–3000
nM c-di-GMP（覆盖大多数细菌菌株的细胞质c-di-GMP水平）范围内，实时荧光信号表现出浓度依赖性增加，荧光强度与c-di-GMPS浓度的自然对数之间存在线性关系（R2=0.9972）（图2g），这与先前研究中报告的CDG-AR137的线性范围一致。在没有c-di-GMP的情况下记录了某些低水平的荧光信号（背景信号）（图2f），这可能是由于非配体诱导的核酶切割的极小部分（图2d），大多数变构核酶都表现出这种现象。![]()
图2 ARC系统在c-di-GMP检测上的实验验证
为了进一步证明这种衍生的CRISPR-Cas12a系统的普遍性，我们改用另一种变构核酶，它可以特异性识别TPP（焦磷酸硫胺素），这是硫胺素在生物学中的活性形式（图3a）。所选的TPP传感变构核酶长123 nt（名称为TPP-AR123）（图3b）。经过合理设计以掺入相同的crRNA序列（与CDG-AR165中的序列相同）后，它变成了一个166nt的ssRNA构建体（命名为TPP-AR166），它也很好地阻断了Cas12a的活性，并且可以被TPP诱导自切割并释放crRNA片段。TPP-AR166—CRISPRCas12a系统使用相同的策略来检查TPP传感（图3c-g）。其中发现了类似的功能特征，包括TPP-AR166的EC50值（68.5 nM）接近TPP-AR123的EC50值（71.1 nM），TPP-AR166-CRISPR-Cas12a系统在TPP的25-1000 nm范围内荧光信号呈线性增加。在没有TPP的情况下，也观察到某些低水平的背景荧光（图3f），这再次被推测是由非配体诱导的核酶切割的一小部分引起的（图3d）。总而言之，ARC系统在小分子检测方面是有效和通用的。![]()
图3 ARC系统在TPP检测中的实验验证
3. TPP-AR166-CRISPR-Cas12a系统高通量筛查血液样本中的TPP水平
变构核酶与CRISPR-Cas12a系统的成功结合将靶诱导的核酶裂解变化转化为荧光信号变化，这大大简化了监测过程，并为高通量筛选分析奠定了基础。为了进一步展示ARC系统的这种能力，团队对血液样品中的TPP水平的进行检测。最近的研究表明，TPP可以成为阿尔茨海默病（AD）的潜在生物标志物。与健康个体（>120 nM）相比，AD患者（<90 nM）的血液TPP含量明显较低。这种血液TPP水平的差异也存在于野生型和转基因AD小鼠之间。后者经常被用作研究AD和开发抗AD药物的模型。团队从野生型和转基因AD小鼠中收集了数十份血液样本（图4a）。在过滤去除细胞碎片后，用TPP-AR166单独孵育这些样本，然后进行CRISPR-Cas12a扩增。随后监测荧光信号并与标准曲线进行比较，以得出每个样本中的血液TPP水平。为排除血液中其他组分通过ARC系统对TPP传感产生的影响，团队通过煮沸血液过滤来降解TPP，使用这个基质进行孵育，观察到单独的TPP-AR166（图4b）和TPP-AR166-CRISPR-Cas12a系统（图4c，d）的切割信号中TPP浓度依赖性增加的类似趋势，表明血液中其他组分对检测系统的影响可以忽略不计。接下来，使用96孔板模拟了TPP的高通量检测并优化了检测条件。总共80个含有不同已知水平TPP的样品（图5a）在23 ℃下（不采用37℃是因为较低温度可以最大限度地减少非配体诱导核酶切割的背景信号）与TPP-AR166单独孵育60分钟。然后将产物引入Cas12a反应系统，在37 °C下反应60分钟，并保存在微孔板中用于荧光监测（图5b）。将信号与标准对照进行比较，并生成直观的热图（图5c），该热图显示，对于所有80个样本，检测到的TPP水平与实际TPP值非常匹配。最后，对24份血液样本通过ARC系统进行TPP评估（图4e-g）。对于每个过滤的血液样本，准备了三种不同的稀释液（4倍、8倍和12倍）。与模拟实验类似，这些样品与TPP-AR166在23°C下单独孵育60分钟，然后在37 °C下在微孔板上进行CRISPR-Cas12a扩增60分钟。值得注意的是，热图分析表明，对应于血液滤液四倍稀释度的样品（第2、5和8列）与八倍（第3、6和9列）和1 倍（第4、7和10列）稀释以及对照组（第1列和第11列）相比，产生的TPP检测值不一致（图4f），说明在相对较高的浓度下，某些血液成分可能会干扰ARC系统。使用从8倍和12倍稀释样品中提取的数据，生成了ARC系统测量的24个血液样品的TPP水平。这些结果与经典HPLC定量法测得的结果非常吻合（图4g）。![]()
图4 ARC系统对血液样本中的TPP水平进行高通量筛查
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图5 ARC系统模拟反应缓冲液中TPP的高通量检测
4. 变构脱氧核酶CRISPR-Cas12a（ADC）系统的工程设计
鉴于近年来几种自裂解脱氧核酶和许多DNA适配体的发现，基于变构核酶的CRISPR检测系统原则上可以转换为基于变构脱氧核酶的系统，由于DNA传感器比RNA传感器更稳定，因此可能具有易于储存和数据生成一致性等优点。作为验证，团队采用自切割脱氧核酶I-R3（类似于自切割锤头核酶）通过合理设计与靶向ATP的DNA适配体融合（图6a-c）。在此，ATP识别的目的是诱导DNA自切割，释放一个5'片段，该片段不是变构核酶系统中的crRNA，而是现在作为引物序列启动RCA扩增或引物延伸反应，以产生激活CRISPR-Cas12a系统的激活剂DNA序列。在没有ATP的情况下，由于引物的3'端存在大的“垃圾”序列，因此不会发生这种级联反应。与变构核酶类似，在这种工程化的ATP依赖性变构脱氧核酶（称为ATP-AD64）上观察到剂量反应效应，估计EC50值为112 μM（图5d，e）。值得注意的是，ATP-AD64似乎继承了所选DNA适配体的配体感应选择性，因为它也可以被腺苷激活，但不能被GTP、CTP和UTP激活。将ATP-AD64与CRISPR-Cas12a系统结合，在10-250μm ATP范围内荧光信号呈线性增加（图5f-i），这表明该ADC系统具有良好的灵敏度。成功构建这种基于脱氧核酶的系统得益于CRISPR-Cas12a三元复合物（激活剂DNA、crRNA和Cas12a蛋白）的丰富可设计空间。![]()
图6 建立用于小分子检测的ADC系统
在这项研究中，团队探索了变构核酶，以开发一种衍生的 CRISPR-Cas系统，用于灵敏、方便和快速地检测非核酸靶标。证明了该系统在两个小分子上的有效性。变构核酶的工作机制，即通过靶结合诱导适配体的构象变化激活核酶，表明这种衍生的CRISPR-Cas系统有可能被设计用于检测一系列不同类型的非核酸靶点，如蛋白质和细胞，因为许多识别这些靶点的适配体已经被鉴定出来，并且可以很容易地掺入变构核酶体中。在TPP的小分子上，进一步验证了ARC系统的高通量检测能力。此外，团队证明了这种系统可以转化为依赖变构脱氧核酶进行靶点识别，这可能更容易操作和储存。简而言之，研究结果突显了变构（脱氧）核酶CRISPR-Cas12a平台作为生化检测的强大分子工具的巨大潜力，为各种科学和临床环境中灵敏、方便和特异的生物分析铺平了道路。
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[1] Fusing Allosteric Ribozymes with CRISPR-Cas12a for Efficient Diagnostics
of Small Molecule Targets. Small Method, 2024, 10, 2401236.
