一种结合CRISPR和数字信号处理的现场核酸检测技术
文摘
科学
2024-08-23 11:09
浙江
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全球范围内，尤其在基础设施有限的欠发达地区由人乳头瘤病毒（HPV）引发的癌症，如宫颈癌，发病率持续上升。宫颈癌每年超过60万新病例，80%以上发生在低收入和中等收入国家。高风险HPV（hrHPV）筛查对缓解这些地区的人口健康压力至关重要。虽然分子诊断方法（如PCR）比传统细胞学更准确，但在中低收入国家地区，面临着技术和成本的挑战。CRISPR技术因其高特异性和现场操作优势，可能成为资源有限环境中快速、准确核酸检测的理想选择。为了解决这些问题，研究团队开发了一种新型现场检测技术CreDiT（CRISPR增强数字检测），用于去中心化的HPV检测和相关癌症筛查。CreDiT结合了扩增、检测目标核酸的Cas反应与高效信号处理，该平台具有以下优点：（i）检测快速（<20分钟）、等温且可在单一试管中完成；（ii）抗干扰能力强，检测可靠；（iii）设备小巧，适合现场使用。基于以上优点，研究团队进一步开发了一个针对癌症诊断的系统，研究团队设计了针对高风险HPV基因（HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV33和HPV58）和癌基因mRNA（E6、E7和p16INK4a）的特异性检测探针组合，优化了核酸提取与检测的流程，并建立一个能够同时处理最多12个样本的CreDiT检测系统。该系统能在35分钟内（包括DNA提取时间）检测到单拷贝的HPV DNA，并准确分类宫颈样本和肛拭子样本中的高风险HPV类型，进一步展示了CreDiT检测系统的多功能性及其在相关临床诊断中的潜力。相关成果以“Empowering the on-site detection
of nucleic acids by integrating CRISPR and digital signal processing”为题发表在国际化学权威杂志Nature Communications上。![]()
图1：用于HPV检测的 CreDiT系统的构建图
首先研究团队对CreDiT系统进行了整体的构建。CreDiT平台结合了核酸扩增（RPA）和Cas12a基因识别，然而激活的Cas12a也可能通过自身切割目标DNA（顺式切割）和降解RPA引物（反式切割）干扰RPA扩增，于是研究团队通过动力学分析表明RPA扩增速度快于Cas12a产生的竞争反应，从而确保了在该检测体系下能够充分扩增目标DNA以实现快速且自动化的核酸检测。为了使CreDiT系统能在POCT检测中发挥优势，研究团队构建了一个自动化检测平台。该平台主要包括旋转样本架、加热模块、光学检测模块和微控制器模块。其中旋转样本架：能够容纳12个PCR管；加热模块：内置电阻加热器和温度传感器用于样本处理以及扩增翻译的温度控制；光学检测模块：包括LED和光电二极管，用于荧光信号的激发和检测；两个微控制器模块：一个控制样本加热，另一个用于信号检测，其中加热控制器根据温度传感器读数调节加热器和风扇的功率，并通过步进电机旋转样本架以进行荧光检测，信号检测控制器处理光信号并生成检测数据。并且研究团队在计算机上实现了用户界面软件，用于设备控制和实时数据分析。![]()
图2：CreDiT光学模块的设计及验证图
研究团队考虑到现场检测的局限性，需要对设备简化设计，然而这种简化往往会影响系统的可靠性和分析能力。因此，研究团队开发了CreDiT光学系统，旨在通过在紧凑的设备中提供高质量的信号来克服这些挑战。研究团队采用了Walsh–Hadamard变换（WHT），这是一种与傅里叶变换类似的数字信号处理技术。WHT利用Walsh函数作为正交基，将时域信号转换为频域表示。WHT的主要优势包括：(i) Walsh函数的二进制性质使其易于与数字系统兼容；(ii) 快速Walsh–Hadamard变换（FWHT）算法高效且轻便，只需要对实数进行加减运算，相比于涉及复数乘法的快速傅里叶变换（FFT）更加简单；(iii) WHT对外部干扰具有较强的鲁棒性，因为它能将信号扩展到宽频带，有效降低了狭带干扰信号的影响。为了将WHT应用于荧光检测，研究团队首先产生一个荧光激发信号，并为Walsh列率索引指定了值，并使用快速Walsh变换（FWHT）将这些值转换为时域波形。该波形驱动LED，激发样品中的荧光染料。在检测路径中，我们通过光电二极管（PD）获取发射光，并通过逆快速Walsh变换（FWHT）对信号进行解调。这个过程揭示了用于调制荧光激发的Walsh序列索引，并且这些索引的峰值与荧光强度（即CreDiT信号）成正比。测量在2.5毫秒内完成，最大程度地减少了荧光染料光漂白的风险。为了确定最优的Walsh列率，研究团队对不同列率下的系统性能进行了评估。在扫动Walsh列率时测量了标准样品（100 µM）的荧光信号。结果显示，列率在97到130范围内实现了高信噪比（SNR）。其中列率107提供了最佳的SNR信。![]()
图3：CreDiT系统加热模块的设计及验证图
研究团队为了确保CreDiT反应的一致性，对检测设备进行了精确的温度控制设计。首先优化了样品架的设计，以便对所有12个样品进行快速而均匀的加热。通过数值模拟，我们确定了带有空心凹槽的架子比实心架子加热更快，这主要是由于其较低的热质量（补充图6）。基于这一设计见解，我们制造了一个铝制的样品架。该架子分为四个象限（图2e）；每个象限容纳三个样品，并嵌入了一对加热器和温度传感器。为了调节架子的温度，我们编程了一款微控制器进行反馈控制：它每100毫秒读取一次温度传感器，平均其输出，并生成加热元件或冷却风扇的控制信号。采用这种方法，我们可以创建适合不同检测步骤的可靠温度曲线（图2f）。平均而言，温度的准确度在±0.3°C范围内，精度为0.6%，由变异系数测得（图2g）。通过整体热分布的记录（补充视频1），也证实了12个样品之间的温度均匀性。![]()
图4：基于POC检测的CreDiT系统优化图
之后研究团队对CreDiT系统的样本提取过程以及试剂的保存进行了优化。对于样品裂解研究团队使用含有蛋白酶K（Pro K）的裂解缓冲液既做到释放细胞中的核酸，又保护核酸免受核酸酶的降解。整个裂解过程为，首先将样品置于裂解缓冲液中，并加热至56℃以激活Pro K，提取核酸后，将样品加热至95℃使Pro K失活。确定了整个流程后，研究团队对其中裂解时间以及Pro K添加量进行了优化，其中裂解时间为15分钟和Pro K浓度为0.5 mg/mL，表现最优。确定了最佳条件后研究团队进行了与标准方法（如商业柱提法）的对比测试，结果显示，两种提取方法获得的核酸质量相似，PCR条带的大小和强度也基本一致，证明两种方法的核酸提取量没有显著差异。研究团队为了使得CreDiT能够克服物流挑战，使其在资源有限的环境中得到应用，评估了在不同环境条件下存储样品和试剂的可行性。研究团队将其各试剂（RPA引物、报告探针、Cas12a gRNAs和Cas12a蛋白）预混并冷冻干燥，便于运输和存储，测试结果表明，冷冻干燥后的预混物在室温下存储至少两周内仍保持有效。![]()
图5：CreDiT系统探针设计与验证图
接着研究团队对CreDiT系统的探针进行设计与验证。探针主要包括：一对正向探针组合、一对反向探针组合以及一条信号探针。这两对检测探针组合包含RPA上下游引物和针对靶区域的两条Cas12a gRNA，分别覆盖靶DNA序列的两端。其中gRNA设计在RPA引物结合位点下游几碱基的位置。研究团队对多种高危HPV亚型（如HPV16、HPV18等）以及相关mRNA设计了探针，随后研究团队对设计的探针进行了验证，实验表明：(i) 只有在所有CreDiT试剂和靶DNA同时存在时，才会产生荧光信号；(ii) CreDiT检测比qPCR更敏感，检测限低至40拷贝/mL，并且在检测时间上也更具优势（20分钟）；(iii) CreDiT探针还表现出优良特异性。
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图6：CreDiT系统对细胞样本检测的性能表征图
确定了相关最优条件后，研究团队对CreDiT进行了真实样本的测试表征。研究团队从不同数量的Ca Ski细胞（HPV16+）中提取DNA，并进行CreDiT检测。结果显示：(i) 在低细胞浓度下，阳性信号与背景信号也存在明显差异；(ii) 从动力学数据中，可以观察到在大约20分钟内，25 µL反应体积的定量限（LOQ）达到了低于单个细胞的水平，因此研究团队将检测时间设定为20分钟；(iii) 20分钟的CreDiT检测具有较好的线性关系且达到了0.8个细胞（33细胞/mL）的LOQ。明确了CreDiT系统检测的性能后，研究团队对其他高危型HPV细胞系进行了验证，如：HPV：Ca Ski（HPV16+）、SiHa（HPV16+）、HeLa（HPV18+）和C-33A（HPV–）。研究团队将GAPDH作为测试参照，为了证明有足够的细胞核酸进入CreDiT系统，确保实验的可靠性。实验结果显示只有目标信号是阳性，而非目标信号都接近背景水平。最后研究团队将CreDiT技术扩展应用于mRNA靶标（如E6、E7和p16INK4a），这些靶标在侵袭性宫颈病变中表现为过表达，是恶性宫颈癌的早期标志。检测这些靶标有助于识别高风险病例，减少过度治疗。为适配mRNA检测，研究团队在CreDiT试剂中添加了逆转录酶，使逆转录过程与CreDiT反应同时进行。CreDiT的结果与金标准RT-PCR一致，并与PCR产物电泳的定性结果保持良好相关性。
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图7-8：CreDiT系统对临床样本检测的性能表征图最后研究团队将CreDiT系统用于临床样本的验证。研究团队收集了临床样本121例，并使用金标准qPCR对这些临床样本进行评估，结果显示HPV16（38例）、HPV18（16例）、HPV45（21例）占阳性比例最高，为了方便分析将其他HPV分型归类与“Others”类别。之后研究团队将剩余的样本进入CreDiT系统进行测试，经过提取、扩增、检测。结果显示CreDiT系统能够准确区分HPV阳性和阴性样本，并成功识别出三种主要的高风险HPV类型（HPV16、HPV18、HPV45），这些结果与临床诊断基本一致。针对三种主要高风险HPV类型（HPV16、HPV18、HPV45），研究团队进一步评估了CreDiT的诊断准确性。根据临床HPV临床病理表现对样本进行分类，使用目标信号与GAPDH内参信号比值（例如，ΔCreDiT HPV16/ΔCreDiT GAPDH）作为诊断指标，数据显示阳性与阴性存在显著差异。后续研究团队根据比值构建了接收者操作特征（ROC）曲线，并确定了优化灵敏度和特异性的阳性临界值。应用这些临界值后，诊断准确率分别为0.975（HPV16）、0.992（HPV18）和0.967（HPV45）。之后研究团队为了展示CreDiT对于其他样本来源的适配性，以相同方式分析了肛拭子样本（n=48）。CreDiT结果再次显示，与临床诊断结果高度一致，达到了较高的诊断准确性。
总之，研究团队开发的CreDiT系统是一种稳定且经济的核酸检测诊断技术，CreDiT系统结合了DNA复制（RPA）和CRISPR/Cas技术，具备高灵敏度和特异性的优点。它简化了检测流程，能够在35分钟内完成样本处理，支持多达12个平行测试，且成本低、易于自动化。CreDiT系统特别适合低中收入国家使用，能有效推动分子检测在临床中的应用和普及，提升筛查和治疗的效率。同时为了提升CreDiT的分析能力和临床转化速度，研究团队提出以下改进措施：(i) 增强CreDiT的检测范围：包括更多高风险HPV亚型（如HPV35、HPV39、HPV51等），提供全面的流行情况分析，助力制定针对性的健康策略；(ii) 实现单管内对多个目标的检测：采用不同的Cas蛋白（如LwaCas13a、LbaCas13a、PsmCas13b）识别并切割标记不同荧光颜色的探针，通过数字解码简化光学组件需求，提高检测效率；(iii)开发具有双隔室的样品管，上隔室预装CreDiT试剂，下隔室容纳提取缓冲液，提取后通过破碎密封自动引入试剂，简化操作并适应自动化需求等。
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[1] Empowering the on-site
detection of nucleic acids by integrating CRISPR and digital signal processing.Nature Communication, 2024, 15: 6271.
