氟原子修饰型gDNA实现基于TtAgo的超灵敏核酸检测
文摘
科学
2024-06-14 10:51
浙江
![]()
Argonautes蛋白与短核苷酸形成二元复合物之后，可以结合或切割序列互补的靶标核酸，该可编程式的核酸酶活性已被广泛用于核酸检测当中。来自Thermus thermophilus的TtAgo是研究最为透彻的Ago之一，然由于不具备解旋酶活性，TtAgo在65℃左右很难高效切割dsDNA底物，这一特性极大的限制了TtAgo在核酸检测中的应用。在这个背景下，来自川北医学院的研究团队通过对gDNA进行化学修饰的方式，提高了gDNA/TtAgo二元复合物对dsDNA底物中target strand的亲和力，从而提高了TtAgo对dsDNA底物的切割活性，并在此基础上开发了一种一锅法核酸检测新方法。相关工作以“Atom-Modified gDNA Enhances
Cleavage Activity of TtAgo Enabling Ultra-Sensitive Nucleic Acid Testing”为题发表于Advanced Science.
(DOI：10.1002/advs.202403120)。1. 2’F-gDNA对TtAgo切割dsDNA底物的促进作用
由于RNA双链间的亲和作用大于DNA双链，而2’F（2’OH替换为F原子）修饰后的gDNA的构象与RNA类似，因此研究人员推测该修饰或许能够提高gDNA与Target DNA间的亲和力，从而促进TtAgo-gDNA-Target复合物形成。为了验证该猜想，他们在gDNA的3’末端修饰了一个2’F，并且对比了2’F-gDNA与未修饰gDNA的Tm值、与dsDNA底物形成三元复合物的能力、与TtAgo的亲和力以及组装成TtAgo-gDNA-Target复合物的效率，结果均与理论推测一致（图1）。随后研究人员测试了2’F-gDNA介导下，TtAgo对dsDNA底物的切割效率，结果显示在65至75℃范围内，2’F-gDNA均能显著提高TtAgo的切割效率（图2）。此外，他们还测试了2’OMe、phosphorothioate
(PS)、LNA以及MGB修饰的效果，除MGB-gDNA外，其余修饰也能提高TtAgo对dsDNA底物的切割能力。为了进一步提高TtAgo对dsDNA的切割效率，研究人员对2’F的修饰位置、数量以及反应条件进行了优化。结果显示在gDNA的3’末端修饰3个2’F（F3-gDNA）时效果最好，在65℃下对dsDNA的切割能力提高了38.1倍。此外，他们还验证了F3-gDNA/TtAgo也有较好的特异性（图3）。![]()
图1. 2’F-gDNA对TtAgo-gDNA-Target复合物组装的促进作用
![]()
图2. 2’F-gDNA提高TtAgo对dsDNA底物的切割效率
![]()
图3. 2’F修饰及反应条件的优化
2. F3-gDNA/TtAgo辅助的一锅法核酸检测新方法的建立与性能表征
研究人员将F3-gDNA/TtAgo与bst聚合酶结合，构建了一种新型核酸检测方法（FAST），其原理如图4所示。检测体系中含有TtAgo、bst聚合酶、硫磺素T、通用的F3-gDNA以及模板核酸，该模板由三部分组成，分别是与待测核酸靶标序列互补的3’末端区域、gDNA识别区域和G4联体模板区域（位于5’末端）。当体系中存在待测靶标时，待测核酸与模板的3’末端区域结合，在bst聚合酶的作用下延伸，而后F3-gDNA/TtAgo识别并切割延伸链，产物在bst聚合酶的链置换作用下解离，形成G4联体后与硫磺素T结合，从而产生荧光信号。为了验证FAST的性能，研究人员构建了针对microRNA-21的检测体系。结果显示FAST可检出低至5拷贝的miR-21核酸，不受miR-31、miR-378、miR-374b、SARS-Cov-2 RNA以及大肠杆菌DNA的干扰，表明该方法具有较好的检测灵敏度和特异性（图5）。而当使用未修饰的gDNA（对应检测体系为CAST）时，仅能检出1000拷贝的miR-21。最后，研究人员测试了FAST对实际样本的检测效果，结果表明相较于RT-PCR技术，该方法具有更好的灵敏度（图6）。图4. FAST原理及可行性验证
![]()
图5. FAST和CAST对miR-21的检测性能
![]()
图6. FAST及RT-PCR对实际样本的检测结果
本研究通过在gDNA的3’末端修饰3个2’F的方式，将TtAgo对dsDNA底物的切割效率提高了约40倍，并在此基础上构建了一种一锅法核酸检测方法，相较于未修饰的gDNA，灵敏度提高了2个数量级。该研究不仅拓展了TtAgo在核酸检测中的应用，还为实现Ago蛋白在低温下高效切割dsDNA底物提供了新思路。
注：该文为最新科研动态新闻报道，如与原文作者有原创冲突，可与本公众号作者联系删除。
[1] Atom-Modified gDNA Enhances
Cleavage Activity of TtAgo Enabling Ultra-Sensitive Nucleic Acid Testing. Advanced Science, 2024,
2403120.
