1. 协同CRISPR-Cas系统检测circRNA的原理
协同CRIPR-Cas系统的检测原理如图1所示。该系统借助特定的crRNA，使Cas13a识别并结合靶circRNA cZNF292的BSJ序列。当靶标序列存在时，Cas13a被激活，其反式切割活性将裂解尿嘧啶碱基之间的磷酸二酯键以解锁被尿嘧啶碱基（UUU，trU）锁定的发夹探针（HP）。解锁的HP将暴露延伸模板序列以启动PER反应——即引物与延伸模板序列暂时结合后，DNA聚合反应开启，且由于d GTP的缺失，该反应将在终止序列（G-C）处停止。PER产物通过引物交换过程脱离模板序列，而模板序列将通过与新引物结合从而引发新一轮的PER反应。最后，PER产物将激活Cas12a的反式切割活性，使其无差别地降解MB-DNA，使得MB分子所携带的负电荷减少，进而通过主客体相互作用在葫芦脲[7]（CB[7]）修饰的电极上富集，实现电化学信号的放大用于circRNA的检测。![]()
图1 协同CRISPR-Cas系统检测循环circRNA的示意图
2. 协同CRISPR-Cas系统检测circRNA的原理
首先，研究团队将含有BSJ位点、具有闭环结构的cZNF292m作为靶标，验证了利用Cas13a解锁HP的可行性。当加入FAM-HP-BHQ时，只能检测到猝灭的荧光信号；而加入无BSJ位点的随机RNA或两端含有部分BSJ位点的线性对照RNA（ZNF292m）时，捕获到的荧光信号与前者无显著性差异；只有当加入靶标cZNF292m时，检测到了强烈的荧光信号（图2A）。上述结果表明只有含有完整BSJ序列的cZNF292m可以特异性激活Cas13a的反式切割活性并解锁HP。进而，研究团队探索了Cas13a的反式切割反应能否开启PER反应。泳道1-4分别代表引物、被锁定的HP、解锁HP、PER产物的条带；泳道5、6分别代表cZNF292m存在或不存在时Cas13a与PER反应混合物的条带（图2B）。结果表明，只有当cZNF292m存在时，Cas13a被激活后，才会产生PER产物及中间结合产物。最后，研究团队证实了以PER为桥梁协同Cas12a及Cas13a反应的可行性，三者能够共同组成circRNA响应的级联信号放大系统。只有在协同CRISPR-Cas系统中加入c ZNF292m时，级联反应开启后，ss DNA底物的条带消失（图2C，泳道3）；反之，ss DNA保持稳定（图2C，泳道4）。![]()
图2 协同CRISPR-Cas系统的可行性验证
3. 协同CRISPR-Cas系统的电化学验证
基于协同CRISPR-Cas系统，研究团队以MB-DNA为信号探针、CB[7]@GE为电极，建立了一种检测circRNA的电化学方法。CB[7]@GE为聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、金纳米颗粒(AuNPs)、CB[7]层层组装制备所得。其中CB[7]为南瓜状的主体分子，能够选择性地包裹阳离子杂环MB分子，形成稳定的1：1主客体复合物。但是，由于长链DNA与CB[7]之间强烈的静电排斥作用，未被切割的MB-DNA将无法进入CB[7]的空腔，只能产生较低的电化学响应。当靶标cZNF292m浓度为80×10-9 M时，研究团队于不同修饰电极上检测到了不同的峰电流（图3A），且只在CB[7]@GE电极上检测到了较高的峰电流，这表明层层组装为MB分子的富集提供了稳定的界面支持。在靶标浓度固定的条件下，不同的CRISPR-Cas反应引发了不同的电化学响应（图3B）：在未进行CRISPR-Cas反应及单独进行CRISPR-Cas12a或CRISPR-Cas13a反应的情况下，电化学响应微弱；只有协同CRISPR-Cas系统触发了显著增强的电化学响应.这证实了Cas12a和Cas13a的协同反应对降解MB-DNA探针至关重要。最后，研究团队验证了该检测方法的特异性。当靶标分别为cZNF292m、线性RNA（序列为cZNF292的BSJ位点）、ZNF292m时，产生了不同的电化学响应。其中，前两者激发的峰电流值相似（图3C），而ZNF292m触发的电化学响应远低于cZNF292m（图3D），这表明完整的BSJ序列对于CRIPSPR-Cas13a的结合和激活至关重要。以上结果证实了电化学检测目标circRNA的可行性，并证明了cZNF292m激活的协同CRISPR-Cas系统有利于级联信号放大。![]()
图3 协同CRISPR-Cas系统的电化学验证
4. 电化学方法检测circRNA的性能评估
在确认可行性后，研究团队进行了多次优化实验探索出了最佳反应条件：锁定HP含有2个trU结构域；PER引物和锁定的HP的添加比例为5：1；Cas13a、PER、Cas12a的最佳反应时间分别为15 min、45 min、20 min。在优化后的反应条件下，研究团队探索了协同CRISPR-Cas电化学检测方法的性能。随着靶标circRNA cZNF292m浓度的增加，峰电流也随之增加（图4A）；且峰电流值与cZNF292m浓度的对数值在4×10-15~40×10-9 M范围内呈线性关系（图4B），从线性回归方程得出该方法的检测限为2.13×10-15M。与现有的circRNA检测方法进行比较，该检测方法在线性范围、检测限和检测时间等方面具备一定的优势。研究团队以与心血管疾病密切相关的miRNA（miR-21）、与cZNF292m存在错配的circRNA(1MUT、2MUT、3MUT)作为对照，考察了该方法的选择性。3MUT及miR-21触发的峰电流几乎与空白对照组一样低，而同时含有cZNF292m和miR-21的混合体系的峰电流与只含有cZNF292m的体系的峰电流几乎相同，均远远高于其它组（图4C）。这些结果表明该方法的高选择性归因于Cas13a对cZNF292m的特异性识别及结合。研究团队进一步验证了该检测方法对于样品类型的普适性，分别于PBS和稀释血清样品中检测cZNF292m（图4D）。从图中可以看出，在两种样品中，每个浓度的峰电流值都有很好的一致性，证明该方法在复杂环境中具有良好的抗干扰能力。![]()
图4 电化学方法检测circRNA的性能评估
5. 利用电化学检测方法对临床样本进行AMI诊断
由于该电化学检测方法具有良好的灵敏度、选择性和抗干扰能力，研究团队将该方法用于检测临床样本(图5A)。临床样本包括10位AMI患者和10位其他心血管疾病患者的全血样本。研究团队首先采用金标准方法（qRT-PCR）检测了临床样本中cZNF292的表达，发现其在AMI患者中表达水平升高(图5B)。通过本文所构建的电化学检测方法检测临床样品所得结果与qRT-PCR结果存在高度相似性（图5C），AMI样本的平均峰电流显著高于非AMI样本（图5D）。同时，小提琴图表明电化学检测方法比qRT-PCR方法具有更好的检测性能（图5E）。但是，在AMI患者血清样本中获得的平均峰电流值显著低于全血样本（图5F），同时无法分辨AMI和非AMI样本（图5G）。该结果与qRT-PCR数据一致，也与之前报道的cZNF292是全血中而非血清中的生物标志物一致。因此，以cZNF292作为靶标，利用协同CRISPR-Cas系统结合电化学方法诊断AMI的方法在全血样分析中具有较高的可靠性和准确性，这可能为AMI的临床诊断提供新的见解。![]()
图5 对临床样本进行检测用于AMI诊断
