双酶级联信号放大的高通量微流控纸基分析装置检测水稻土中亚砷酸盐甲基转移酶基因
文摘
科学
2024-05-17 11:01
浙江
大米吸附砷的能力强，在膳食结构中占有重要地位。砷已被世界卫生组织列为一级致癌物，可导致各种疾病，如皮肤病、心血管疾病和癌症。一般来说，砷的毒性取决于其化学形态，无机三价形态的毒性远大于有机五价形态。微生物介导的砷甲基化是水稻土中无机砷向有机砷转化的关键过程，这一过程是由亚砷酸盐甲基转移酶基因(arsM)介导的。水稻土中arsM丰度与甲基化砷呈显著正相关。因此，arsM是水稻土系统中砷甲基化的重要生物标志物，检测arsM可以在砷解毒调查中提供关键信息，并帮助个人筛选砷风险。目前，arsM的分析主要依赖于基因组测序和实时荧光定量PCR
(qPCR)。然而，这些方法在arsM筛选中的广泛应用受到例如成本高、测试周期长、样品要求高以及对超净实验室条件的限制。因此，开发一种用户友好且经济的定点使用（POU）方法对于基于arsM的水稻土砷潜在风险评估至关重要。CRISPR是一项新兴技术，因其特异性强、信号转导能力优异、反应相容性优异，因此受到了广泛的关注。但是由于Cas12a本身存在敏感性不足等问题，在环境样品中直接应用Cas12a进行核酸分析可能比较困难。来自中国科学院地球化学研究所的团队构建了一种多重CRISPR/Cas12a微流控纸基分析装置(μPAD)，通过偶联crRNA增强的Cas12a和辣根过氧化物酶(HRP)修饰探针驱动级联扩增，用于arsM的高通量POU分析。相关工作以“High-Throughput μPAD with
Cascade Signal Amplification through Dual Enzymes for arsM in Paddy Soil”为题发表在于Analytical Chemistry。平台传感器原理如图1所示。在arsM存在下，Cas12a - crRNA识别目标序列并进行顺式切割。然后，激活复合物反式切割活性，将ssDNA连接的磁珠和HRP切割，然后分离。接下来，在磁力作用下，珠子留在底部，而分离的HRP留在上清中。最后从上清转移到TMB溶液中，颜色迅速变为蓝色。然而，在没有arsM的情况下，复合物不能被激活，HRP仍然与小珠相连，在外磁铁作用下存在于试管底部。由于上清中没有HRP, TMB不能被催化成蓝色。![]()
图1 基于crRNA - HRP的耦合分析平台原理
团队首先根据arsM序列和Cas12a的识别原理设计了7种靶向arsM不同区域的crRNA。采用2倍连续稀释梯度浓度质粒评价其灵敏度和背景信号。如图2和3所示，除crRNA6外，背景信号均为低信号。因此，该研究设计的crRNA灵敏度高，背景信号低，为构建耦合系统提供了重要依据。然后，通过逐步迭代的方法构建了6种不同数量crRNA的耦合方法，探索增加crRNA的数量是否可以持续提高CRISPR/Cas12a检测系统的灵敏度。如图4所示，crRNAs 1和2或1、2和3的耦合并没有提高灵敏度或降低背景信号。当进一步引入crRNA 4时，LOD从7.8 pM下降到1.9 pM。进一步引入crRNAs 5、6、7也提高了灵敏度，偶联所有crRNAs时灵敏度最高，检出限为0.12 pM。现象表明耦合系统的检测性能主要取决于配合物之间的相互作用，而不是它们的属性。![]()
图2 arsM检测的实时荧光曲线
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图3用Cas12a-crRNA检测arsM的终点荧光
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图4 基于耦合crRNA系统的终点荧光检测arsM(a−f)基于crRNA 1−2、crRNA 1−3、…、crRNA 1−7偶联体系的arsM检测终点荧光曲线。
随后团队根据偶联体系构建反应，同时将探针改为HRP探针。使用不含arsM和含125 pM arsM的样品评估反应，并通过荧光和比色法观察结果。如图5a所示，实验组在575 nm处颜色明显较对照组深，荧光值明显高于对照组，验证了目前检测arsM方法的可行性。由于现场分析难以实现实时监测，终点检测可能更合适。反应时间对终点分析的检测性能至关重要。反应时间过短时灵敏度过低，反应达到饱和时灵敏度过低，反应时间过长时定量能力下降。因此，进行了时间优化。如图5b所示，当反应时间为30 min时，扣除背景后，低浓度arsM样品没有荧光，即使在高浓度arsM样品中，荧光值仍然很低。反应时间时增加到40 min时，低浓度和高浓度的arsM样品的荧光值都大大提高。然而，进一步增加反应时间并没有提高高浓度和低浓度arsM样品的信号强度，表明反应达到饱和。因此，选择40 min作为最佳时间。接着对该方法的定量范围和检出限进行了评价。如图5c、d所示，该平台在16 fM - 125 pM之间表现出良好的定量能力(R2 = 0.98)，LOD低至16 fM，比耦合方法低8倍。在HRP探针引入之前，浓度信号效应并不大。这种现象可能是由两个因素造成的。首先，该平台反应时间短，避免了反应饱和。其次，级联扩增策略进一步扩大了由浓度差异引起的ssDNA裂解率的变化，更好地反映了浓度的变化。然后，探讨了比色法在POU分析中的便捷性。如图5e、f所示，比色法的灵敏度达到16 fM。随着arsM添加量的增加，TMB溶液的颜色变深，表明有很大的浓度-颜色效应。然后通过ImageJ提取比色信号，R2达到0.94，显示出良好的定量能力。值得注意的是，荧光或灰色数据与arsM浓度的拟合曲线均为指数函数，表明偶联系统与HRP探针结合产生了级联扩增效应。指数函数的指数小于1，这可能是由于随着arsM浓度的增加，HRP的颜色逐渐饱和。![]()
图5 基于HRP的耦合crRNA系统平台的可行性分析、时间优化及性能检测
然后团队制备了高通量μPAD设备。该设备结构与操作步骤如图6所示，设备由纸芯片和PMMA板组成，纸芯片由亲水性白色区（作为流体迁移通道）和疏水性黑色区（用于约束流体）浸泡在蜡中形成；PMMA板通过激光切割机制造，用于培养反应。利用时，首先取出展开的纸屑，按步骤2折叠。接下来，将裂解液添加到区域4的玻璃纤维中，然后按照步骤3进行纸张折叠。然后，通过添加洗涤缓冲液至少两次去除杂质。待玻璃纤维完全干燥后，按照步骤4折叠纸，然后加入洗脱缓冲液将DNA转移到微流控板中，最后，将平板密封以待反应。![]()
图6 μPAD的原理和折叠步骤
最后，团队利用该平台对水稻土中arsM进行了现场筛选。如图7a所示，团队在铜仁市万山选取了16个地块，用4个平行样品进行质量控制，用比色法分析丰度。采用系统聚类和主成分分析(PCA)方法，探讨了影响arsM丰度的环境因素。如图7c、d所示，大多数指标与arsM之间没有明显的关系。arsM与As的关系似乎也不显著，可能是因为As含量的变化很小，不会影响arsM的丰度。![]()
图7 arsM的POU分析及其与环境指标的关系
本研究开发了一种基于crRNA - HRP耦合的级联扩增μPAD用于arsM检测，检测限为16 fM，动态范围高达5个数量级(16
fM ~ 125 pM)，具有低背景信号、高通量(多达32个检测通道)、检测时间快(1 h)等特点，且反应在恒温下进行，结果可通过肉眼观察。此外，μPAD价格低廉，大大降低了检测成本。水稻土中arsM的筛选表明μPAD在实际样品分析中是非常可靠的。由于其模块化组装策略，该平台还可以通过替换环境中的crRNA来应用于其他核酸生物标志物，这进一步证明了其在高通量POU分析方面的巨大潜力。
[1] High-Throughput μPAD with Cascade Signal Amplification
through Dual Enzymes for arsM in Paddy Soil. Anal. Chem., 2024, 96, 16, 6337–6346.
