基于Ago的免扩增核酸检测技术在耐药性细菌检测中的应用
文摘
科学
2024-09-20 11:21
浙江
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由于传播快、死亡率高和治疗的选择有限，产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌（CPE）感染已成为全球范围内的重大公共卫生问题。当前的CPE检测方法主要为培养法和聚合酶链式反应（PCR），存在检测时间长，操作复杂，并且依赖专业设备和熟练的操作人员等缺陷。Argonaute是一类具有可编程核酸内切酶活性的蛋白，已被广泛应用于核酸检测当中，但现有的方法仍然需要进行核酸扩增，同样存在操作复杂的缺点。在这个背景下，来自韩国生命科学与生物技术研究所的研究人员建立了基于Argonaute高严谨的编程化核酸酶活性的基因电路（ANCA），实现了对CPE的一步法免扩增检测。该方法可在不进行核酸提取和扩增的情况下，直接检出血液或尿液中的CPE。相关工作以“ANCA: artificial nucleic acid
circuit with argonaute protein for one-step isothermal detection of
antibiotic-resistant bacteria”为题发表于Nature
Communication（10.1038/s41467-023-43899-4）。1. ANCA设计原理
ANCA体系含有TtAgo、向导核酸G1和G2、荧光信号分子R以及R的互补链R*（图1）。首先TtAgo-G1和TtAgo-G2复合物识别与G1、G2互补的靶标核酸，并在其特定位点切割，产物T1的5末端带有磷酸基团，因此可以与空的TtAgo形成TtAgo-T1，该复合物可识别并切割荧光信号分子R，此时不仅可以产生荧光信号，且产物T2能够进一步引导TtAgo在互补链R*的特定位点切割，再次产生T1，从而进入循环过程。![]()
图1. ANCA设计原理
2. ANCA反应的可行性验证和优化
研究人员首先分析了普通的Ago电路和本研究开发的ANCA电路的区别。由于缺乏关键组分即信号分子R的互补链R*，在普通Ago电路中，T1只能引发对信号分子R的切割，因此信号产生的过程是线性的；而ANCA电路中引入了互补链R*，可以循环产生T1，因此信号是指数上升的。实际结果与理论分析一致（图2），仅当ANCA电路的所有组分以及待测靶标同时存在时，产生了明显的荧光信号，而同样浓度的待测靶标在普通的Ago电路中是无法被检出的。为了提高ANCA体系的性能，研究人员对反应的温度以及各组分的浓度进行了优化（图3），选择了75℃、25
nM G1、25 nM G2、500 nM R、500 nM R*、200 nM TtAgo、10 mM MgCl2、75 mM NaCl、10 µg/mL BSA进行后续研究。![]()
图2. ANCA可行性验证
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图3. ANCA反应条件优化
3. 碳青霉烯酶基因KPC和IMP检测体系的性能验证
针对常见的碳青霉烯酶基因KPC、IMP、VIM、NDM、OXA-48，研究人员设计了对应的ANCA体系，并使用优化后的条件测试了各体系的灵敏度（图4、5）。结果显示每个体系中的靶标核酸浓度与信号之间均具有较好的线性关系，因此可进行定量检测。经计算，KPC、IMP、VIM、NDM、OXA-48体系的灵敏度分别为1.87 fM、178 aM、529 aM、120 aM、144 aM。由于ANCA的反应温度高达75℃，因此可以通过热裂解的方式使细胞破裂从而释放核酸，且高温会破坏体液样本中可能会干扰反应的一些物质，因此可以免除复杂的样本处理和核酸提取过程。实验结果也证明了ANCA体系可以直接检出血液和尿液中的带有KPC和IMP耐药基因的肺炎克雷伯菌，且两个体系均具有较好的特异性（图6）。![]()
图4. KPC和IMP检测体系的灵敏度
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图5. VIM、NDM和OXA-48检测体系的灵敏度
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图6. KPC和IMP检测体系的鲁棒性
4. 临床检测性能的评估
研究人员测试了KPC和IMP体系对临床样本的检测效果（图7）。针对KPC体系，他们对143个直肠拭子样本（63个KPC阳性，80个阴性）进行了测试，结果阳性样本全部检出，阴性样本检出79个。为测试KPC体系的特异性和灵敏度，他们又制备了57个加标的模拟阳性样本进行测试，结合143个临床样本，最终得到特异性为98.7%，灵敏度为100%。针对IMP体系，由于没有收集到IMP阳性的肺炎克雷伯菌感染样本，因此他们对收集到的160个阴性样本中的80个样本进行加标，最终测定的特异性和灵敏度均为100%。此外，他们还发现，将直肠拭子直接丢进ANCA体系中检测时，KPC体系的特异性也能达到100%，优于先将拭子置于转移缓冲液中，再取缓冲液进行检测的效果。经分析，这可能是因为缓冲液起到了稀释作用，从而导致了靶标核酸浓度的降低。最后，研究人员还制备了3D纳米材料，用于收集环境样本（皮肤、桌面、剪刀、手套、门把手、镊子等）中的细菌，再结合ANCA技术进行CPE检测，结果显示KPC和IMP体系均能检出上述环境样本中的靶标核酸，且具有较好的特异性（图8）。图7. 直肠拭子样本的检测结果
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图8. 环境样本检测结果
本研究利用TtAgo的可编程性核酸内切酶功能，设计了具有循环放大功能的基因电路ANCA，并将之用于碳青霉烯耐药性细菌的检测。ANCA体系具有良好的鲁棒性，可以在不进行样本处理和核酸提取的情况下，直接检测血液样本和尿液样本；且ANCA体系组成简单，操作便捷，只需一步反应即可完成检测，降低了交叉污染的风险；本研究中的ANCA体系的灵敏度在100 aM-1 fM左右，仍需进一步优化提高。总的来说，该研究拓展了基于Ago蛋白的核酸检测应用，并且为CPE的快速检测提供了新的思路。注：该文为最新科研动态新闻报道，如与原文作者有原创冲突，可与本公众号作者联系删除。
[1] ANCA: artificial nucleic acid circuit with
argonaute protein for one-step isothermal detection of antibiotic-resistant
bacteria. Nature Communications, 2023, 14, 8033.
