背景与历史
启动时间：1990年，目标是绘制完整的人类基因组序列。 完成情况：2003年完成了85%的基因组序列，2022年完成了所有缺失片段的填补。 历时：32年完成了完整的人类基因组测序。 技术对比：最初使用的是Sanger测序技术，一次只能测序一条DNA链。而NGS技术可以同时测序数十亿条DNA链，大大提高了速度。 NGS的诞生与发展： 通过NGS技术，测序一个人的全基因组只需一天，显著缩短了测序时间。 NGS技术依赖于人类基因组计划创建的参考基因组。
NGS的原理与步骤
样品处理
样品收集：收集目标DNA或RNA样本。 DNA/RNA纯化：提取并纯化样品，确保样本纯净且无降解。 RNA逆转录：如果目标样品为RNA，需通过逆转录将RNA转化为cDNA（互补DNA），才能进行后续的DNA测序。
文库构建
DNA片段化： 使用高频声波或酶将长链DNA切割成短片段。 片段的长度根据应用需求进行特定控制。 添加适配子（Adapters）： 适配子是添加到每个DNA片段两端的短DNA序列。 这些适配子包含了测序仪器所需的序列信息，还包含样品标识（Index），用于区分不同的样本。 文库纯化与扩增： 通过磁珠等方法去除未结合的适配子，保证文库的质量。 根据具体应用，可能加入PCR扩增步骤来增加文库的量。 一个成功的文库需达到指定的片段长度和足够的浓度，才能进入下一步测序。
测序准备与合成
流动池表面准备： 测序发生在玻璃表面的流动池（Flow Cell）中，流动池表面附有与文库适配子序列匹配的寡核苷酸（Oligonucleotides）。 文库加样与变性： 将文库片段通过变性（Denaturation）处理，转变为单链DNA。 单链DNA与流动池表面的寡核苷酸结合，形成DNA链。 克隆扩增（Clonal Amplification）： 使用PCR技术对文库片段进行扩增，以便形成簇（Cluster），增加荧光信号的强度。 过程：DNA链通过桥式PCR扩增，形成多个拷贝（双链DNA），然后将双链分离，重复此过程形成大量局部簇。最终切割掉反向链，留下前向链用于测序。
测序过程
测序合成（Sequencing by Synthesis, SBS）： 原理：测序时通过DNA聚合酶将荧光标记的核苷酸（A、T、G、C）依次加入待测DNA链中，每次加入一个碱基，荧光信号被相机捕获和记录。 每种碱基（A、T、G、C）带有不同颜色的荧光标签和终止子，确保每个循环只能加入一个碱基。 测序步骤：
加入带荧光标签的核苷酸，碱基配对。 相机记录每个簇的荧光信号（颜色）。 去除终止子，继续加入下一个核苷酸，重复此过程，直到完成预设的测序长度。
指数（Index）测序：通过标识序列区分不同的样本。 多重样本测序：利用独特的双重指数标签，最高可同时在一个流动池中处理384个样本。
双端测序生成两个来自同一片段的读取（一个来自前向链，一个来自反向链），增加了测序的准确性，尤其是长片段分析。 过程：前向链测序完成后，创建桥接结构使反向链成为模板，接着对反向链进行测序。
数据处理
质量控制与过滤： 在测序完成后，过滤掉质量较差的读取，如重叠的簇、强度过低的簇，以及多重簇的情况。 去重与解复用（Demultiplexing）： 利用样本指数（Index）将不同样本的读取分离。 比对与组装： 将过滤后的读取比对到参考基因组上，重组DNA片段，并通过算法识别和定位这些片段。 深度与覆盖度： 读数深度（Read Depth）：指某个核苷酸被测序的次数。常规全基因组测序需要30倍的平均读数深度，癌症研究中检测稀有突变时需要更高的读数深度（如1500倍）。 覆盖度（Coverage）：目标是确保测序过程中目标区域没有遗漏，覆盖率越高，数据越完整。
参考文献
