一、流式细胞术概述
流式细胞术（Flow Cytometry） 是一种基于光学的强大工具，用于快速分析悬浮液中单个细胞或颗粒的物理和化学特性。流式细胞仪通过使细胞依次通过激光束，检测细胞对激光的散射和荧光信号，从而获得多参数的细胞数据。
流式细胞术的关键优势：
高通量：一次实验能够分析数千至数百万个细胞，几秒内完成大规模数据收集。 单细胞多参数分析：一次实验可同时测量单个细胞的多个参数，如细胞大小、颗粒性、表面标志物和内部复杂性。 数据精确度高：通过荧光信号与细胞大小等物理参数结合，提供精确的亚群分析。
核心应用：
免疫表型分析（Immunophenotyping）：通过荧光标记的抗体鉴定不同的免疫细胞亚群。 细胞周期分析：评估细胞群体的不同周期阶段。 细胞凋亡检测：通过标记凋亡相关分子检测细胞凋亡情况。 细胞活力检测：结合活细胞与死细胞染料，分析细胞活力状态。
二、荧光原理
荧光过程的三个阶段：
激发（Excitation）：荧光分子吸收激光能量，电子从基态跃迁到激发态。 激发态寿命（Excited Lifetime）：荧光分子处于激发态的时间极短，通常为纳秒级。 发射（Emission）：电子回到基态时释放多余的能量，以较低能量的光子形式发射，波长比激发光更长。
斯托克斯位移（Stokes Shift）：
斯托克斯位移是指激发光的波长与发射光波长之间的差异，发射光总是比激发光的波长长、能量低。这个位移是区分不同荧光染料发射信号的基础。利用这种位移可以有效避免激发光与发射光的混淆。
荧光染料的选择：
三、流式细胞仪的组成与工作原理
流式细胞仪的三个主要组成部分是流体系统、光学系统和电子系统。
流体系统
流体系统的作用是将悬浮液中的细胞带入激光束，并确保细胞以单细胞形式流经检测区域。
流体动力聚焦（Hydrodynamic Focusing）：样本被注入鞘液中，鞘液围绕样本液流，确保细胞单个穿过激光束，避免多个细胞同时通过带来的信号干扰。 流速调节：
光学系统
光学系统的作用是收集和处理来自细胞的光散射和荧光信号。它由激光光源、检测器、镜片和滤光片组成。
激光光源：不同波长的激光用于激发不同的荧光染料。常用的激光波长包括488 nm（蓝光）、633 nm（红光）等。 光散射：当细胞通过激光束时，会发生前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），分别用于测量细胞大小和内部复杂性。 滤光片：用于选择并过滤不同波长的光。常见的滤光片包括带通滤光片、长通滤光片和短通滤光片。 带通滤光片（Bandpass Filter）：允许特定波长范围内的光通过，如530/30滤光片允许515-545 nm波长的光通过。 长通滤光片（Long-pass Filter）：允许比某一波长长的光通过。 短通滤光片（Short-pass Filter）：允许比某一波长短的光通过。 二色镜（Dichroic Mirror）：将光按波长分离，反射不需要的光波，传递所需的波长。
电子系统
光电倍增管（PMT）：用于检测来自荧光染料的微弱光信号，并将其放大为电信号。 光电二极管（Photodiode）：用于检测较强的信号，通常用于前向散射信号。 信号转换：荧光信号和散射信号被检测器捕获后转化为电压脉冲，这些脉冲随后通过计算机分析。
四、流式细胞数据的表示与分析
流式细胞仪能够生成大量数据，并通过多种图形形式表示，帮助科学家分析和解释细胞特性。
数据文件格式
FCS文件格式：流式细胞数据保存为标准的FCS文件（Flow Cytometry Standard），可供后续分析。这种格式允许跨不同软件平台重新分析数据。
数据可视化
单参数直方图：展示单个参数（如荧光强度）的分布。X轴表示信号强度，Y轴表示细胞数量。用于分析细胞群体的荧光强度分布。 双参数点图（Dot Plot）：展示两个参数（如前向散射和侧向散射）的关系。每个点代表一个细胞，用于分析细胞群体的多维特性。 密度图（Density Plot）：类似于点图，但通过颜色表示细胞密度，颜色越深表示细胞密度越高。
门控（Gating）
布尔逻辑门控：通过布尔逻辑（AND、OR）结合多个门控区域，可以定义更加复杂的细胞群体。
五、荧光补偿
在流式细胞术中，多个荧光染料可能会有发射光谱的重叠，导致在多个通道中检测到交叉信号。这种现象称为 光谱串扰（Spectral Overlap）。为了消除这种交叉干扰，需要进行补偿操作。
补偿的概念
补偿步骤
单色对照：使用每种荧光染料单独标记的细胞或微球，测量它们在不同通道中的发射光谱。 调整补偿参数：通过实验调整补偿参数，消除其他荧光染料信号的影响，使每个通道的信号只代表目标染料。
补偿控制
阴性对照：使用未标记的细胞或微球，用于检测背景荧光和非特异性信号。 阳性对照：单独标记的细胞或微球，用于确定不同荧光染料的补偿值。 抗体捕获微球：在低表达抗原的情况下，可以使用抗体捕获微球，确保每种荧光染料产生足够的信号用于补偿。
六、数据展示与实验设计
数据展示
在展示流式细胞数据时，选择合适的刻度对数据的解释至关重要。可以使用线性刻度或对数刻度：
线性刻度：用于显示较小范围的信号变化，适合如DNA含量分析等需要精确显示细微差异的实验。 对数刻度：用于显示荧光信号范围较广的实验，有助于同时观察强信号和弱信号的分布。
试验设计
为了设计有效的流式细胞术实验，以下因素至关重要：
荧光染料的选择：需要根据仪器的激光配置和检测通道来选择荧光染料。强荧光染料应与低表达的抗原配对，而弱荧光染料适用于高表达抗原。 补偿控制：确保使用单色对照和阴性对照，以便准确补偿光谱重叠问题。
实验控制
FMO（Fluorescence Minus One）对照：实验中应使用FMO对照来确定荧光染料的阴性阈值。每个FMO对照都缺少目标荧光染料，从而帮助划定阴性群体。 生物学对照：确保实验结果的生物学相关性，常通过使用已知的生物学模型细胞系或样本。
七、流式细胞术的常见问题与注意事项
荧光补偿的调整：即使某些荧光染料看似没有显著的光谱重叠，仍建议进行补偿，因为即使小的重叠也可能影响结果的精确度。 不同刻度的选择：实验数据的显示应根据实验要求选择线性或对数刻度，确保结果可读且易于解释。 光降解问题：荧光染料（尤其是串联染料）易受光降解的影响，实验操作中应尽量避免长时间暴露在光照下。
参考文献
