共聚焦显微镜和荧光显微镜的基本原理
荧光显微镜： 荧光显微镜使用单波长光源（如488nm的激发光）激发样本中的荧光分子（如FITC或GFP），收集样本发出的荧光。 由于该显微镜没有聚焦选择能力，样本中上层和下层的荧光都会进入镜头，导致图像模糊和带有背景噪声。 此外，非目标平面的荧光也会被记录，进一步增加图像模糊度。 共聚焦显微镜： 共聚焦显微镜通过激光扫描和针孔，选择性地收集特定焦平面上的光，消除上下层的散光，获得更清晰的图像。 使用激光作为光源，通过相干性使其能够聚焦到非常小的区域（称为激光腰部），从而精准激发焦平面上的荧光分子。 共聚焦显微镜不仅提供更高的分辨率和图像质量，还支持三维成像功能。
激光与普通光源的区别
激光光源的优势在于其相干性，即激光的光波相位一致，能够集中到极窄的焦点（激光腰部），从而精准地激发焦平面上的荧光分子。 普通光源则不具备这种相干性，激发的区域较大，无法避免同时激发其他非焦平面的荧光分子，导致图像模糊和背景噪声增加。
共聚焦显微镜的主要特性之一是其光学切片功能，通过调整载物台与物镜之间的距离，逐层成像。 由于样本的不同焦平面可以逐层成像并被堆叠在一起，系统能够构建样本的三维重建图像，从而使得样本的三维结构得以可视化。
增益（Gain）与偏移（Offset）的调整
增益（Gain）： 增益是指通过调节探测器的电压来提高信号强度。增益越高，信号越强；但增益过高会导致图像过度饱和，细节丢失。 增益调整的原理是通过增加电压，提高光电倍增管（PMT）的灵敏度，从而增加信号输出。 偏移（Offset）： 偏移用于调整基线信号（即背景噪声），通常通过施加负电压减少热电子等噪声信号的影响。 正确调整偏移可以消除不必要的背景噪声，确保图像的清晰度。
动态范围的利用
动态范围（Dynamic Range）指图像中从最低亮度到最高亮度的灰度值范围。良好的动态范围意味着图像能够同时捕捉到亮部和暗部的细节。 低动态范围的图像可能过亮或过暗，导致细节丢失，而高动态范围则能够平衡亮暗对比，展示丰富的图像信息。
数字变焦与分辨率提升
数字变焦可以在不改变图像尺寸的情况下，通过缩小扫描区域，增加像素密度，从而提高图像的分辨率。 数字变焦并不会直接增加实际的成像倍数，而是通过缩小扫描的范围，将更小的区域投射到与原图相同的图像尺寸上，使像素更加密集。
扫描模式
共聚焦显微镜使用激光作为光源，有多种扫描模式可选，用于控制激光的扫描方式：
Galvanometer扫描仪：速度较慢，适合静态样本，扫描速率为1-5帧/秒。 共振扫描仪：速度较快，适合动态过程的成像，扫描速率为30帧/秒，适用于观察快速生命过程。 混合扫描仪：结合了两者的优点，既能高精度扫描静态样本，也能快速捕捉动态过程。
探测器
共聚焦显微镜常用的探测器是光电倍增管（PMT），其核心功能是将弱光信号转换为可检测的电信号。常见的两种探测器类型如下： 多碱探测器：这种探测器容易出现电子损失，导致信号效率较低。 混合探测器：通过特殊的设计减少了电子损失，提高了探测器的效率和信号质量，适合高分辨率成像。
图像质量的决定因素
像素驻留时间：激光在样本上的停留时间，如果时间过长，样本的荧光分子可能会漂白；如果时间过短，无法获得足够的信号。 激光强度：激光强度如果过高会导致图像过度曝光，动态范围失衡；如果过低，则无法有效成像。 针孔直径：针孔直径过大会导致非焦平面光进入探测器，影响图像清晰度；直径过小会削弱信号。 荧光染料质量：染料的质量对图像质量影响巨大，劣质或老化的染料会降低成像效果。 探测器性能：探测器的质量决定了信号的敏感度和捕捉效率，混合探测器在高分辨率成像中表现优越。
参考文献
