qPCR简介
qPCR的应用
qPCR具有多个应用场景：
基因表达定量分析：检测不同条件下基因的表达水平，分析基因功能。 病毒载量检测：定量分析样品中的病毒含量，例如COVID-19病毒RNA检测。 病原体检测：检测样品中的细菌、病毒或真菌DNA/RNA。 基因拷贝数检测：分析特定基因或质粒在细胞中的拷贝数。
qPCR工作原理
qPCR实验步骤
1. 实验试剂
模板DNA/cDNA：要检测的目标DNA或cDNA。 引物（Primers）：前向和反向引物，用于特异性扩增目标基因。 dNTPs：用于DNA合成的基础原料。 荧光染料：如SYBR Green，结合到双链DNA上产生荧光信号。 Taq聚合酶：扩增DNA的酶。
2. PCR反应设置
将试剂混合，加入到PCR管或96孔板中。 反应管放入qPCR仪器，开始扩增反应。
3. PCR循环
变性（95°C）：加热分离DNA双链。 退火（引物结合，50-65°C）：引物与模板DNA特定区域结合。 延伸（72°C）：Taq聚合酶延伸DNA链，产生更多的双链DNA。
4. 荧光检测
每次延伸结束后，qPCR仪器检测荧光信号的强度。随着循环次数的增加，荧光信号逐渐增强，反映了DNA的扩增量。
Ct值（循环阈值）
融解曲线分析
qPCR数据分析
ΔΔCt法（相对定量分析）
ΔCt值：目标基因Ct值减去参考基因Ct值。 ΔΔCt值：实验组ΔCt减去对照组ΔCt。 相对表达量：
举例：
对照组：目标基因Ct = 20.5，参考基因Ct = 18.0 实验组：目标基因Ct = 19.0，参考基因Ct = 18.2
ΔCt对照组 = 20.5 - 18.0 = 2.5 ΔCt实验组 = 19.0 - 18.2 = 0.8 ΔΔCt = 0.8 - 2.5 = -1.7 相对表达量 =3.24
# 加载必要的库library(dplyr)# 样本数据data <- data.frame(Sample = c("样品1", "样品2", "样品3", "样品4"),Group = c("对照组", "对照组", "实验组", "实验组"),Ct_Target = c(20.5, 21.0, 19.0, 19.5), # 目标基因Ct值Ct_Reference = c(18.0, 18.1, 18.2, 18.0) # 参考基因Ct值)# 步骤1：计算ΔCtdata <- data %>%mutate(Delta_Ct = Ct_Target - Ct_Reference)# 获取对照组的平均ΔCt值作为校准值calibrator <- mean(data$Delta_Ct[data$Group == "对照组"])# 步骤2：计算ΔΔCtdata <- data %>%mutate(Delta_Delta_Ct = Delta_Ct - calibrator)# 步骤3：计算相对表达量（Fold Change）data <- data %>%mutate(Fold_Change = 2^(-Delta_Delta_Ct))# 打印结果print(data)# 导出数据到CSV文件write.csv(data, "qpcr_results.csv", row.names = FALSE)
ΔCt值：计算目标基因和参考基因Ct值的差值（ΔCt）。该值用于反映目标基因相对于参考基因的表达量。 ΔΔCt值：实验组ΔCt与对照组平均ΔCt的差值（ΔΔCt）。ΔΔCt值越小，表示目标基因在实验组中的表达量越高。 Fold Change（相对表达量）：Fold Change > 1表示上调表达，Fold Change < 1表示下调表达。
八、qPCR实验优化技巧
引物设计：设计高特异性的引物，避免引物二聚体和非特异性扩增。 扩增效率：理想的扩增效率应接近100%，即每个循环中模板数量应增加一倍。 RNA质量：高质量的RNA和反转录效率是获得可靠数据的关键。 操作规范：移液准确性、样品制备等操作直接影响实验结果。
九、常见问题和解决方法
非特异性扩增：优化引物退火温度，使用梯度PCR。 引物二聚体：使用融解曲线分析来检测，引物设计时避免二聚体形成。 荧光信号过弱：检查模板量、引物设计和扩增效率。
Derveaux, S., et al. (2010). How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods, 50(4), 227-230.
一家人就要整整齐齐的：PCR、RT-PCR、qPCR、qRT-PCR
