ddPCR 的工作原理
1. 样本分区
液滴生成：ddPCR系统将待检测的核酸样本分割成约20,000个纳米级液滴。每个液滴都包含一定数量的核酸模板。 微流体技术：通过专利的微流体技术和表面活性剂，ddPCR能有效将样本均匀分配到每个液滴中。这种分区使得每个液滴内的PCR反应相互独立，有助于提高检测的灵敏度和精确度。
2. PCR 扩增
液滴转移：生成的液滴被转移至96孔板中，准备进行PCR扩增。 热循环：利用兼容的热循环仪对液滴进行PCR扩增。在每个液滴内，特定的目标DNA分子会被复制，从而在最终检测中呈现出不同的荧光信号。
3. 液滴读取
单滴分析：扩增后，液滴被送入ddPCR读取仪进行逐个分析。设备使用双通道检测系统（通常为FAM和HEX/VIC），能够检测到不同的目标。 阳性和阴性液滴计数：每个液滴的荧光强度被测量，阳性液滴（含有目标DNA的液滴）会显示出高于阴性液滴的荧光信号。通过Quantasoft软件，仪器统计阳性和阴性液滴的数量。
4. 结果分析
泊松分布计算：通过阳性和阴性液滴的比例，Quantasoft软件使用泊松统计方法来推算样本中目标DNA的绝对初始拷贝数，单位为每微升拷贝数。 结果可视化：实验结果通常以荧光强度与液滴数量的散点图形式呈现，其中阳性液滴被标记并赋值为1，阴性液滴赋值为0。这种数字化信号使得目标DNA浓度的计算更加直观和精准。
ddPCR 的实验步骤
样本准备：
需要对待检测的DNA或RNA样本进行初步准备，通常包括选择合适的引物和荧光探针（如FAM、HEX或VIC）。 使用专门为液滴生成开发的超级混合试剂进行样本混合。
将混合后的样本放入qx200液滴生成器中，利用其专利技术和微流体机制，将样本分割成20,000个均匀的液滴。
将液滴转移至96孔板中，使用标准热循环仪进行PCR扩增，确保每个液滴内的目标分子得到充分复制。
扩增完成后，液滴被转移到qx200液滴读取仪中，逐个进行荧光检测。根据不同的荧光通道，软件会识别阳性和阴性液滴。
通过Quantasoft软件，统计阳性和阴性液滴的数量，并根据泊松分布法计算样本中目标DNA的绝对浓度。
ddPCR 的应用优势
绝对定量：ddPCR技术能够提供目标DNA的绝对拷贝数，无需进行标准曲线的建立，特别适合用于病毒载量分析和微生物定量。 高灵敏度和精确度：大规模样本分区使得ddPCR能够检测到样本中微小的拷贝数差异，具有更高的精确度和灵敏度。 信噪比提高：背景中高拷贝模板被稀释，使得目标DNA的信号增强，有助于灵敏地检测稀有目标。 消除PCR偏倚：ddPCR不依赖扩增效率，减少了qPCR中常见的偏倚，提高了检测结果的可靠性。 简化定量流程：无需使用校准曲线或Delta Delta CQ法，操作简便，减少了实验的复杂性。 降低消耗品成本：反应体积极小（从皮升级到纳升级），显著减少了所需试剂量和样本量。 降低设备成本：基于乳液的反应系统使得PCR可以在标准热循环仪中完成，避免使用昂贵的芯片或微流体设备。 提高分区数量：每20微升样本产生的20,000个液滴相较于芯片型数字PCR系统产生的数百或数千个液滴，提供了更高的分区精度和更可靠的结果。
