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与其它化学药物不同，PROTAC分子不符合“类药五原则” （Rule of Five , eRo5）。尽管PROTAC分子所占据的空间超出了传统的口服吸收空间，但仍然具有较高的口服潜能。为了理解PROTAC生物利用度的决定因素，Arvinas公司的Keith R. Hornberger和Erika M. V. Araujo于近期在Journal of Medicinal Chemistry上发表了题为Physicochemical Property Determinants of Oral Absorption for PROTAC Protein Degraders的文章。作者对PROTAC的口服吸收与常见的物理化学性质进行了分析，讨论了PROTACs在eRo5/bRo5 (beyond Rule of Five, bRo5)空间中的位置，并为口服PROTACs的设计总结了关键的理化性质约束条件。一、用fa × fg值表征分子的口服生物利用度
在本文的核心观点中，作者认为，用Fobs来表征分子的口服生物利用度是存在缺陷的。![]()
口服生物利用度F的定义为吸收分数fa、胃肠道有效通过分数 fg、肝有效通过分数fh的乘积（公式1）。其中fa × fg很难通过实验测量得到，但是可以对其进行估算。理论上，一个化合物被完全口服吸收，没有经过肠道代谢， fa × fg = 1，理论最大生物利用度（Fmax）可以通过公式2确定。![]()
因此，fa × fg可以近似为实验观察到的生物利用度与理论最大生物利用度的比值（公式3）。作者认为，这个公式假定了测量的静脉清除率完全来自于肝脏，如果缺乏对肝外清除机制的纠正，将会导致错误的fa × fg值。![]()
为了证明上述的观点，作者对比了两个Fobs均为5%的分子，化合物A有较高的肝脏清除率(90% Qh)，而化合物B的肝脏清除率较低(10% Qh)。由于化合物A的Fmax仅为10%，fa × fg为0.50，且该化合物的生物利用度明显较低，但其吸收能力相对较好。而化合物B的Fmax为90%，fa × fg为0.06，该化合物的吸收相对较差。简而言之，fa × fg值比Fobs更适用于衡量吸收能力，因为它适当地考虑了化合物的肝脏清除率并使其标准化。![]()
通常而言，具有良好PK的分子需要高于20%的口服生物利用度Fobs及较低的肝脏清除率 (<25% Qh)，计算可得fa × fg需大于0.25。于是作者将fa × fg=0.25作为具有良好口服吸收的PROTAC分子的阈值。作者对Arvinas公司的1806条PROTAC分子在大鼠中静脉注射和口服的PK数据进行分析，发现75%的化合物都具有中等或较低的清除率，说明清除率不是主导因素。233个化合物由于清除率大于肝血流量，导致无法对fa × fg进行有意义的评估，从而从数据中被剔除。![]()
图1. 大鼠中Cl/Qh 值的分布(n=1806)
随后作者对其中的1016个化合物进行分析，对小鼠（Qh=90 mL/min/kg）和大鼠（Qh=55 mL/min/kg）分别计算fa × fg值。结果显示，85%（861/1016）的PROTAC分子的fa × fg值在大鼠中低于小鼠中，说明大多数PROTAC分子在大鼠体内的口服吸收比小鼠差，在药物吸收方面大鼠对于药物的筛选更为严格。![]()
图2.使用fa × fg值比较大鼠和小鼠PROTAC分子的吸收分数。
二、化合物理化性质与fa × fg值的关系规律总结
于是作者以大鼠为模型，研究剔除无意义数据后的1573个化合物分子的理化性质与fa × fg值的关系，总结了以下fa × fg≥0.25的理化性质条件：![]()
l氢键供体HBD ≤ 4是fa × fg≥0.25的明确上限。在分析结构后作者发现，几乎所有（97%）fa × fg≥0.25的化合物（含有3或4个HBD），都具有1或2个分子内氢键供体，说明HBD最好少于2个。因此分子的设计有一定的灵活度，可以在有2个HBD基础上增添额外的1~2个分子内HBD。
l氢键受体HBA≤15。
l可旋转氢键RB≤14，拓扑分子极性表面积TPSA≤200 Å2。在Veber规则中，大鼠口服生物利用度需要RB ≤ 10且 TPSA ≤ 140 Å2，在这项工作中扩展了传统口服生物利用度的范围。
l分子量≤ 950, 1≤ c log P≤ 7, 0≤ c log D≤ 6。
l芳香环数NAr≤ 5。但NAr =5的化合物仅有9%有较好的肠道吸收，因此最佳的是NAr≤ 4。
lAbbVie multiparametric score（AB-MPS）≤ 20。AB-MPS是c log D 、NAr 、RB的组合，但AB-MPS并不比单一参数更具有预测口服吸收的能力。
作者比较了Ro5 + Veber、bRo5和PROTACs口服吸收的理化性质的上限。在HBA、RB、TPSA、MW和c log P空间比传统的Ro5更大，但只有MW、HBA和c log P接近bRo5的极限。部分原因可能是这些计算出的物理化学描述符并不是完全独立的变量，MW、TPSA,、MW and RB之间存在关联。相比之下，HBD在Ro5空间有严格的限制。即使在传统的Ro5中，HBD也被认为是口服吸收的主要限制，也是分子设计中最严格的限制。![]()
三、理化性质约束条件在PROTAC分子设计上的应用
作者计算了在代表性泛素连接酶配体（ULM）——CRBN和VHL上的理化参数，以及20个最具代表性的linker的平均理化参数，从而建立了一个适合口服吸收的PROTAC分子的饼图。蓝色、黄色分别代表了ULM配体、linker所占的理化参数空间，绿色指为蛋白质靶向配体设计预留的空间。![]()
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作者提出，要获得具有较高口服利用度的PROTAC分子，需要合理考虑ULM，例如在本文数据集中仅有很少使用VHL的分子达到fa × fg≥0.25。同时，可以根据指南进行合理的靶蛋白配体设计以及linker的优化，以获得成药性较好的分子。此外，作者发现大鼠的PROTAC口服利用比小鼠更加受限。由于小鼠对口服吸收的相对宽容，需要更好地整合跨多个物种的药代动力学数据，以支持最终的临床进展。本文提出的fa × fg的分析方法依旧存在局限性，这是因为根据大鼠的口服吸收阈值推测人体口服吸收阈值是经验性的，并且缺乏大量先进的临床数据对本分析方法进行排除。本文作者：ZZY
