利用PROTAC技术对抗应激激素受体激活
文摘
科技
2023-12-22 16:58
北京
糖皮质激素（GC）与压力应激病理相关。在压力环境下，下丘脑-垂体-肾上腺轴激活，导致GC释放到血液中，与靶细胞胞质中的糖皮质激素受体（GR）结合并激活后者，使其入核、二聚，发挥其转录因子的功能。GR表达水平失调或过度激活会导致应激相关精神疾病的发生。目前临床上使用的GR拮抗剂存在各种问题，如米非司酮（Mifepristone, MIF)，其同时也能与孕激素受体、雄激素受体等结合，存在诸多副作用。
近日，来自瑞士苏黎世神经生物学中心、苏黎世联邦理工学院和苏黎世大学的Katharina Gapp团队在Nature Communication上发表了题为Harnessing PROTAC technology to combat stress hormone receptor activation的文章，展示了他们关于GR降解剂KH-103的研究成果。作者团队利用地塞米松作为GR端配体，分析地塞米松-GR和胆汁酸的共结晶结构，确定了Linker延伸的位置，并测定了Linker的理论最小长度。基于这些结果，作者团队合成了4种不同Linker的分子(KH-95, KH-99, KH-102, KH-103)，通过在HEK293细胞系中的WB实验验证发现，在1 μM浓度条件下，两种带有PEG链Linker的分子均不能诱导降解，而两种带有烷基链Linker的分子可以在1小时左右达到半数降解、16小时内达到完全降解，其中KH-103的降解活性表现更为优异。接下来，作者尝试在更低浓度下测试其降解活性，结果表明，在10 nM浓度下，KH-103依旧能发挥优异的降解活性，能在4小时达到半数降解。 ![]()
![]()
接下来，作者在HEK293细胞系中测试了KH-103降解机制的蛋白酶体依赖性。正如预期的那样，在20μM蛋白酶体抑制剂MG-132的存在下，KH-103的GR降解活性被抑制。此外，通过培养基洗除KH-103可以在24小时内几乎完全逆转GR的降解程度，而不洗除降解剂的情况下，GR的降解可以维持长达96小时。随后，作者在其他多种细胞系上进行测试，发现KH-103在A549、N2a等多种细胞系中也存在对GR的降解活性。![]()
地塞米松与GR结合后，会改变其构象、促进其入核。为了验证KH-103是否与地塞米松有类似的功能，作者在HEK293和A549两种细胞系上进行了免疫荧光染色实验，发现KH-103和地塞米松都只需要在30分钟内就能显著诱导GR入核，但随后KH-103组中核内的GR信号就开始随时间持续减弱，说明KH-103诱导GR的降解主要是通过细胞核内的UPS系统完成的。![]()
由于GR基因表达时可以产生多种不同的mRNA，GR拥有不同亚型，如GR-A, GR-P, GR-α, GR-β, GR-γ等，之间的差距主要体现在C端，而C端正是与配体结合的区域。同一mRNA从不同的起始位点开始翻译又可以产生更多翻译亚型，例如GRα就有GRα-A, GRα-B, GRα-C1-C3, GRα-D1-D3等多种翻译亚型。作者构建了不同的质粒，在不同亚型的C端和N端引入2×HA标签和FKBP12F36V的序列，用于被dTAG降解，以作为降解性评估的内参，探究了KH-103不同GR亚型的降解活性，观察到只有拥有完整C端配体结合域的GR-α和GR-γ才能被HK-103降解，而且在C端引入2×HA标签FKBP12F36V的序列也不会影响三元复合物的形成。![]()
作者认为GR-PROTAC是一种有前景的工具，以实现GR基因组功能和非基因组功能的被动消除。GR-PROTAC补充了在健康和疾病背景下研究遗传资源的现有工具箱，在应激相关神经精神疾病、库欣综合征以及治疗GR相关癌症转移方面具有巨大的临床应用潜力。本文作者：YZL
