衰老细胞会对肿瘤治疗产生负面影响。衰老细胞会产生促炎症的衰老相关分泌表型因子，这些因子可以促进肿瘤生长、免疫抑制、血管生成等。此外，衰老细胞可以长期处于休眠状态，这使得它们成为肿瘤复发的潜在风险因素。因此，清除衰老细胞至关重要。现有药物主要包括Bcl-2家族抑制剂、HSP90抑制剂、MDM2抑制剂这几类，但均存在脱靶效应和耐药性的问题。
衰老相关的β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal）是一种广泛使用的衰老细胞生物标志物。其主要特征是在衰老细胞中活性显著增加，因此常用于检测衰老细胞。此外，β-半乳糖苷酶也是许多靶向衰老细胞药物设计的平台。这些药物通常包含β-半乳糖苷结构，与已知药物或靶向小分子抑制剂连接，利用衰老细胞中高表达的β-半乳糖苷酶选择性激活释放药物，从而杀死衰老细胞。2024年4月18日，美国University of Arizona化学与生物化学系的Wei Wang教授团队在Journal of Medicinal Chemistry上发表了题为Selective Elimination of Senescent Cancer Cells by Galacto-Modified PROTACs的文章。基于已有PROTAC分子ARV-771和MS99，作者设计合成了Galacto-Modified PROTACs，Gal-ARV-771和Gal-MS99。研究结果表明，Gal-ARV-771和Gal-MS99的抗衰老指数均高于ARV-771和MS99。在A549异种移植小鼠模型中，依托泊苷和Gal-ARV-771的联合治疗可显著抑制肿瘤生长，而不引起显著毒性。ARV-771的VHL配体的羟基对招募VHL E3泛素连接酶至关重要。作者通过碳酸酯键连接的4-羟基苄醇基团，将半乳糖基团（Gal）连接到ARV-771的VHL配体的羟基上，从而实现对VHL配体羟基的封装（Figure 1A）。该Gal-ARV-771在正常细胞中由于半乳糖基团的封装而保持无活性，但在酯酶和SA-β-gal联合作用的情况下，Gal-ARV-771可以在16小时内几乎完全转化为ARV-771（Figure 1B）。 ![]()
Figure 1. Gal-ARV-771的设计、合成和触发释放研究
为得到衰老的A549细胞（s-A549），作者利用低剂量的etoposide诱导A549细胞，实验结果显示s-A549细胞中衰老细胞生物标志物SA-β-gal的表达明显增强（Figure 2A,B），证明诱导成功。利用ARV-771处理正常的A549细胞（n-A549）和s-A549细胞，在这两种细胞中都能检测到BRD4的降解（Figure 2C）。而用Gal-ARV-771处理时，只有在s-A549细胞中能检测到BRD4蛋白的降解，而在n-A549细胞中未能观察到（Figure 2D）。此外，实验结果表明，MG-132、VHL配体和MLN- 4924均能抑制Gal-ARV-771和ARV-771的降解能力（Figure 2E），表明Gal-ARV-771和ARV-771均依赖于泛素-蛋白酶体途径。 ![]()
Figure 2. Gal-ARV-771在衰老的A549细胞中触发泛素-蛋白酶体依赖性的BRD4降解
用不同剂量的ARV-771和Gal-ARV-771分别处理n-A549细胞和s-A549细胞72小时后，细胞活性测定结果显示，Gal-ARV-771对n-A549和s-A549细胞的IC50值分别为3.29 μM和640 nM，senolytic指数为5.17（Figure 3A）；而ARV-771对n-A549和s-A549细胞的IC50值分别为354 nM和603 nM，senolytic指数仅为1.59（Figure 3B）。用1 μM ARV-771或Gal-ARV-771分别处理n-A549细胞和s-A549细胞24 h后，用FITC和PI染色进行流式细胞术分析。结果显示，在n-A549细胞中，与Gal-ARV-771（8.07%）相比，ARV-771显示出更高比例（20.1%）的早期凋亡；而在s-A549细胞中，ARV-771（17.0%）和Gal-ARV-771（16.7%）显示出相似的抗肿瘤活性。以上结果表明，与ARV-771相比，Gal-ARV-771具有更高的选择性。![]()
Figure 3. Gal-ARV-771对依托泊苷诱导的衰老A549细胞具有选择性活性
为了展示他们的前药策略在衰老细胞选择性蛋白降解方面的潜在广泛应用，作者使用该平台设计并合成了第二个基于VHL的PROTAC，Gal-MS99（Figure 4A），它针对一个完全独立的蛋白靶点NPM-ALK。在正常的Karpas 299细胞中，即使使用1 μM的Gal-MS99，NPM-ALK也不会降解（Figure 4B）；而在衰老的Karpas 299细胞中，NPM-ALK可以被MS99和Gal-MS99降解（Figure 4C）。具体来说，Gal-MS99在正常和衰老的Karpas 299细胞中对NPM-ALK降解的IC50值分别为2.162 nM和454.8 nM，senolytic指数为4.75（Figure 4D）；而MS99在正常和衰老的Karpas 299细胞中对NPM-ALK降解的IC50值分别为368.8 nM和232.4 nM，senolytic指数仅为1.59（Figure 4E）。以上实验结果表明，该前药策略具有广泛的应用潜力，能够选择性降解多种不同的衰老细胞靶点。 ![]()
Figure 4. Gal-MS9在衰老的Karpas 299细胞中降解NPM-ALK蛋白
接下来，作者利用A549异种移植小鼠模型检测了Gal-ARV-771的耐受性和治疗效果。将A549细胞移植到严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠的两侧腹部，当形成的肿瘤体积达到80-100 mm3时，给小鼠注射5 mg/kg依托泊苷诱导细胞衰老。同时给小鼠每天注射Gal-ARV-771（20 mg/kg）或ARV-771（20 mg/kg），单独或与依托泊苷联合用药，持续19天（Figure 5A）。结果显示，ARV-771和Gal-ARV-771均能显著抑制依托泊苷处理的小鼠的肿瘤生长，肿瘤生长抑制率分别为80%和74%（Figure 5B）。在A549小鼠模型中，单独使用Gal-ARV-771并没有显著抑制肿瘤生长，这表明Gal-ARV-771的治疗效果需要依托泊苷诱导的细胞衰老（Figure 5C）。免疫组化检测显示，依托泊苷和Gal-ARV-771的联合治疗显著降低了肿瘤中BRD4的表达水平（Figure 5D,E），和肿瘤细胞的增殖标志物Ki-67的表达（Figure 5D,F），同时增加了凋亡标志物裂解的Caspase-3的表达（Figure 5D,G）。这些结果表明，该前药的抗肿瘤效果是由于诱导了衰老细胞的凋亡。 ![]()
Figure 5. Gal-ARV-771具有良好的耐受性和体内抗衰老活性
为了评估Gal-ARV-771对衰老细胞中BRD4的影响，作者对n-A549和s-A549细胞进行了全局蛋白质组学分析，观察到与正常细胞相比，衰老细胞中BRD4的表达水平显著降低，衰老相关生物标志物L1CAM的表达量也发生了显著变化（Figure 6A）。此外，蛋白水平发生显著变化前五的蛋白还包括ARGAL和BTBD8（Figure 6B）。蛋白质组学数据进一步证明了Gal-ARV-771在化学诱导的衰老细胞中的降解能力。![]()
Figure 6. A549细胞中Gal-ARV-771的蛋白质组学分析
总结：这项研究结果表明，基于SA-β-Gal激活的PROTACs Gal-ARV-771和Gal-MS99能在SA-β-Gal高表达的癌性衰老细胞中被选择性地激活并释放蛋白质降解剂ARV-771和MS99，这些前药能够降低多种衰老癌细胞的细胞活力，显示出广泛的治疗应用前景。在A549肺癌小鼠模型中，Gal-ARV-771和依托泊苷的联合治疗能有效抑制肿瘤生长。Gal-PROTACs能以亚化学计量和催化的方式降解靶蛋白，这将有助于减少耐药性。作为一种新颖强大的工具，Gal-PROTACs可用于选择性消除引发复发的衰老癌细胞，以及缓解其他与人类衰老相关的疾病。本文作者：LT
