7月4日，诺华公司在Science上报道了一种用于胎儿血红蛋白诱导的WIZ转录因子的分子胶降解剂。该团队通过对CRBN偏向化学文库的表型筛选发现了dWIZ-1 和 dWIZ-2分子，其为WIZ转录因子的分子胶降解，同时强烈诱导HbF（胎儿血红蛋白）。
镰状细胞病（SCD）是一种普遍的、危及生命的疾病，可归因于β血红蛋白的遗传突变。多年研究表明，胎儿血红蛋白（Hb）的治疗性诱导可以改善疾病并发症。然而，安全有效的HbF小分子诱导剂难以发现。目前SCD最有效的口服疗法是羟基脲(HU)，它具有缓解疾病的功效并提高生存率，其临床疗效部分源自 HbF 的适度再激活，目前安全有效的HbF诱导药物仍然是一个重要的未满足需求。
转录因子（TF）通过蛋白质-蛋白质相互作用发挥作用，在药物发现中使用传统方法抑制仍然具有挑战性。利用邻苯二甲酰亚胺药物作为IKZF1和IKZF3的偶然的、CRBN依赖性降解剂的最新机制特征，作者假设化学上不同的分子胶降解剂可能降解含有锌指 (ZF) 的转录因子。 因此，诺华团队设计了一个大型CRBN偏向配体库，用于表型药物发现。
图1：基于CRBN的HbF小分子诱导剂的发现
通过表型筛选发现WIZ作为HbF诱导的调节因子
为了鉴定诱导 HbF 的小分子，作者首先在原代人 CD34+ 衍生的成红细胞中开发了一种高通量筛选测定法，在培养13天后通过流式细胞术测量增殖、分化和HbF表达。已知的 HbF 诱导剂，如 HU、地西他滨（DNA甲基转移酶抑制剂）和UNC0642（EHMT1和EHMT2赖氨酸甲基转移酶抑制剂）可诱导 HbF，但表现出不良的抗增殖作用。接下来，作者利用该测定法筛选了2814个CRBN偏向分子的文库（图1A至C）。三种化合物增加了 HbF 阳性细胞的百分比，同时避免了成红细胞的增殖和分化，其中化合物 C（图 1B）在进一步表征后因具有优异的吸收、分布、代谢和排泄 (ADME) 特性而被优先考虑。化合物 C增加了HbF阳性细胞的百分比，半数最大有效浓度 （EC50） 为100 nM，同时不影响成红细胞增殖和分化（图1D 和E）。在CRISPR-Cas9导致CRBN缺陷的成红细胞中没有观察到HbF诱导（图1F），这表明化合物C通过蛋白质降解依赖性机制来诱导HbF。
图2：WIZ作为HbF表达负调节因子的靶标识别和表征
为了进一步确定化合物C的潜在靶标，作者通过质谱法对蛋白质稳定性进行了无偏分析。 用10 mM化合物C或二甲基亚砜(DMSO)对照处理原代人成红细胞6小时。在8960个定量蛋白质中，下调最显着的蛋白质是 WIZ TF（2.6 倍，P = 0.0001；图 2A）。化合物 C被证明对WIZ具有选择性，没有其他蛋白质下调超过两倍。值得注意的是，逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）没有观察到 WIZ mRNA 表达的变化，这支持了转录后对 WIZ 丰度的影响。通过在用 WIZ 过表达构建体转导的 293T 细胞中进行免疫印迹，确定了化合物 C对 WIZ蛋白水平的有效剂量依赖性作用（图2B），并通过流式细胞术测量原代人成红细胞[半最大降解浓度(DC50)为13nM；图2C]。作者将这种化学探针重新命名为 dWIZ-1。
由于小分子探针可能具有脱靶后果，因此作者在健康供体的原代人成红细胞中使用 CRISPR-Cas9测试了WIZ丢失对HbF的影响。使用两个独立的单向导RNA（sgRNA）进行WIZ敲除（KO）显著提高了γ-珠蛋白mRNA、HbF细胞（图2D）和总HbF（图2E）的比例。
为了进一步评估 WIZ 耗竭对体内造血和成红细胞发育的影响，作者使用了一种已建立的人源化异种移植模型，该模型支持人类骨髓中的红细胞生成。使用 CRISPR-Cas9，他们在健康人类供 CD34+ HSPC中用两个独立的sgRNA 敲除 WIZ，并使用非靶向或安全靶向 sgRNA 生成两个阴性对照组。随后，作者移植了NBSGW 小鼠(30只)，并在16周后评估了移植、多系分化以及外周血和骨髓中的 HbF 诱导。WIZ 靶向组和对照组的早期和晚期植入具有可比性（图2F）。WIZ缺陷的HSPC重新填充骨髓（图2G）并重建B、T、骨髓（图2H）和红系谱系（图2I）的正态分布。值得注意的是，WIZ缺陷的成红细胞会去抑制 HbF（图 2，J-L），这进一步验证 WIZ 是体内以前未被识别的 HbF 抑制因子。
dWIZ-1作为WIZ分子胶降解剂的表征
尽管 WIZ 的结构特征此前尚未报道，但AlphaFold的序列分析和建模提出了11个假定的ZF，其中5个作为配对ZF出现。通过类比ZF依赖性IKZF1招募至CRBN-DDB1泛素连接酶复合物，作者测试了dWIZ-1 WIZ招募至 CRBN-DDB1以触发靶向蛋白质降解的论点。七个 WIZ ZF包含其他已知CRBN新底物中存在的CxxCG 基序。
作者首先使用基于细胞的 NanoBiT 蛋白-蛋白招募测定评估了化合物诱导的WIZ和 CRBN关联，其中随着SmBiT-CRBN接近LgBiT-WIZ，生物发光增加。如图所示。S5B、dWIZ-1 增加CRBNWIZ关联，EC50为547 nM。在HiBiT标记的WIZ过表达细胞系中，在存在或不存 neddylation抑制剂(MLN4924)、泛素激活酶抑制剂(MLN7243)和蛋白酶体抑制剂的情况下，用dWIZ-1处理，评估随后的WIZ蛋白酶体依赖性降解（硼替佐米）。使用每种泛素蛋白酶体途径抑制剂治疗可恢复 WIZ 稳定性，与E3依赖性蛋白酶体降解一致。
为了鉴定 WIZ 开放阅读框中的 dWIZ-1 degron，作者研究了ZF7至ZF10，它们都存在于人类原代成红细胞中表达最高的亚型中。 作者引入靶向每个β发夹环中的甘氨酸残基的点突变，该突变已被证明对结合其他 CRBN 新底物至关重要。ZF7 中的 G876N 突变完全挽救了 HiBiT 标记的过表达细胞系中的 WIZ 降解，而 ZF8 （G1049N）、ZF9 （G1233N）、ZF10 （G1403N） 和 G1049N/G1233N/G1403N 组合中的类似突变对 WIZ 降解的效力或深度没有影响（图3A）。总之，这些数据支持 WIZ（ZF7）作为参与三元复合物形成的主要 ZF，通过在 NanoBiT 表达系统中通过 dWIZ-1 将 WIZ（ZF7）剂量依赖性募集到 CRBN 在功能上得到证实。
图3：WIZ通过ZF7被招募到CRBN
为了确认 WIZ ZF 在体外的直接结合，他们使用表面等离子体共振（SPR）测定了重组 WIZ ZF与 DDB1：CRBN：dWIZ-1 复合物的结合。其观察到 WIZ（ZF7）与 DDB1：CRBN：dWIZ-1 复合物的结合，亲和力为 3.5 μM ± 0.6 μM（图3B）。值得注意的是，在没有dWIZ-1的情况下，未观察到 WIZ（ZF7） 与 DDB1：CRBN 的结合（高达10μM），并且在 dWIZ-1 存在的情况下未观察到单独与 DDB1 的结合，表明化合物和CRBN依赖性结合。相比之下，WIZ（ZF8/ZF9）和WIZ（ZF10）均未显示出与DDB1：CRBN：dWIZ-1复合物的结合。
在dWIZ-1（3.1 Å;图3C）。dWIZ-1配体在CRBN和WIZ（ZF7）之间以三元复合物的形式结合。CRBN采用闭合构象，将N末端结构域定位在谷胱酰亚胺识别口袋附近。该复合物让人联想到先前确定的CRBN三元复合物，其中β发夹甘氨酸（G876）容纳邻苯二甲酰胺环，并允许谷胱酰亚胺环结合到三色氨酸口袋中。dWIZ-1 使用 N351、H378、W380 和 W400 协调一系列与 CRBN 的氢键相互作用。WIZ（ZF7） 使用 V874 与 dWIZ-1 建立额外的氢键（图 3、D 和 E）。dWIZ-1在 CRBN：WIZ（ZF7） 之间产生氢键相互作用，包括 N351：E873、H357：V874 和 W400：C875 对。这种“分子胶”型相互作用在CRBN和WIZ（ZF7）之间形成了一个紧密埋藏的表面积，只有乙基哌啶部分暴露于溶剂中（图3C）。计算出的CRBN和WIZ（ZF7）之间的埋地表面积为413.8 Å2，CRBN 和 dWIZ-1之间的电压为 305 Å2WIZ（ZF7）和dWIZ-1之间的值为152 Å2 (图3F）（33,34）。与 Ikaros（Q146）和 CK1α（I35）的空间冲突为 dWIZ-1 对这些已知 CRBN 脱靶的选择性提供了一种可能的解释。总的来说，这些数据有力地支持了 dWIZ-1 通过直接结合 CRBN 诱导 HbF 表达以及随后通过 WIZ（ZF7） 募集和 WIZ 蛋白酶体降解的论点。
用于药理靶点验证的 WIZ 类药物降解剂
为了扩展体内 WIZ 降解和 HbF 诱导的研究，先导化合物优化工作确定了一种名为 dWIZ-2 的化学类似物，其中去除了dWIZ-1的手性甲基，从而改善了药代动力学 (PK) 特性（图 4A）。用dWIZ-2 处理 SCD 衍生的成红细胞，使HbF表达细胞的百分比以及总 HbF 从媒介物处理样品中的平均基线17%增加到10 mMdWIZ-2处理样品中的 45%（图4B ）。与载体对照相比，dWIZ-2暴露导致强烈且剂量依赖性的WIZ降解（平均65%），伴随着骨髓中HbF+人成红细胞比例的增加（42%对10%；P<0.0001）（图4C））。HbF+ 人成红细胞的增加与高效液相色谱 (HPLC) 测量的 HbF表达分数呈正相关（r = 0.9；19% 对比 <0.8%；图 4D），并且主要由 g-珠蛋白的增加驱动 mRNA 转录本（26%与2%；图 4E）。为了扩展体内 HbF 诱导的评估，我们给健康食蟹猴口服 30 mg/kg 每天的 dWIZ-2 或载体对照，持续 28 天。g-球蛋白 mRNA 的外周检测与第 15 天外周表达 HbF 的网织红细胞的增加相一致，在用 30 mg/kg dWIZ-2 治疗的三只动物中，有两只在当天达到 >90%HbF+ 网织红细胞（图 4、H 和 I）。第 15 天，大多数动物中未观察到 F 细胞，但第 28 天出现在外周，这与 HbF+ 网织红细胞成熟为 HbF+ 红细胞一致（图4J）。值得注意的是，HbF 诱导的实现对测量的血小板、血细胞比容或中性粒细胞没有影响（图4K）。
图4：用于 HbF 诱导的优化 WIZ 分子胶降解剂
总的来说，作者利用表型筛选来靶向WIZ这种历史上难以解决的蛋白质靶点。该工作提供了dWIZ-1和dWIZ-2作为机理和转化研究的化学探针，并揭示了WIZ作为SCD研究的一个潜在治疗靶点。
